基于网络药理学探究黄连⁃干姜药对治疗手足口病的作用

曹志明吴巧凤

（浙江中医药大学药学院，浙江 杭州310053）

手足口病（Hand⁃foot and mouth disease，HFMD）自2008 年纳入丙类传染病以来，一直成为丙类传染病中发病率最高的疾病［1］。HFMD 多发生于5 岁以下的学龄儿童，其临床症状主要为发热，手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹，重症者可导致死亡。HFMD 的常见病原体为柯萨奇病毒A16 型（Coxsaekievirus type A16，CA16）和肠道病毒71 型（Enterovirus 71，EV71），其中EV71 导致HFMD 的轻症、重症和死亡病例数分别占HFMD 轻症、重症和死亡病例数的40.2%、61.9%、92.9%［2］。

迄今，临床尚无治HFMD 的特效药，仅能采取药物（如芦平曲韦和利巴韦林等）进行对症治疗。中医认为HFMD 属于“瘟疫，温热夹湿”等范畴，常以清热解毒中药进行治疗［3］，如黄连、金银花和连翘等。研究发现黄连中的盐酸小檗碱可通过激活AKT、抑制JNK 和PI3K Ⅲ蛋白磷酸化抑制EV71 诱导的自噬［4］。但黄连性寒，易伤脾胃，常与温热药物（干姜，紫苏和厚朴等）配伍使用。黄连⁃干姜药对最早出自于《伤寒论》 中的干姜黄芩黄连人参汤和半夏泻心汤［5］，两药一寒一热，相互制约，共奏调理肠胃，消痞除满之效。但黄连⁃干姜药对抗HFMD 的研究未见报道。

网络药理学是基于药物⁃成分⁃靶点⁃疾病为基础的交互式网络，涉及化学信息学、生物信息学、网络生物学和药理学等诸多学科［6］，可系统性地揭示药物与疾病间的复杂关系，进而阐释中药配伍的潜在机制［7］。分子对接是通过计算蛋白（受体）三维结构与成分（配体）之间几何和能量匹配程度，从而达到筛选活性成分的目的［8］。本文运用细胞实验、网络药理学和分子对接预测黄连⁃干姜药对治疗HFMD 的潜在靶点、机制及其活性成分，为深入研究黄连⁃干姜药对治疗HFMD 的靶点、机制和活性成分及新药研发提供参考。

1 材料

1.1 药物与试剂 利巴韦林（批号20181202），购自湖北百科药业股份有限公司；MEM 培养液（批号1760237）、胎牛血清（批号1347575）、谷氨酰胺（批号1677185）、25% EDTA⁃胰酶（批号1737903）、PBS（批号1740269）均购自美国Gibco 公司；黄连（批号20170601）和干姜（批号20190801），均购自浙江中医药大学中药饮片厂，经浙江中医药大学中药资源与鉴定教研室俞冰副教授鉴定，分别为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch 的干燥根茎和姜科植物姜Zingiber officinaleRosc 的干燥根茎。

1.2 病毒和细胞株 肠道病毒71 型（EV71）、横纹肌瘤细胞株（RD），均由浙江省疾病预防控制中心病毒所提供。1.3 仪器 705 型－80 ℃超低温冰箱、3111 型CO2 恒温培养箱（美国Thermo 公司）；ABI⁃7300 Real⁃time 检测仪（美国ABI 公司）。

2 方法

2.1 细胞实验

2.1.1 药物提取 黄连⁃干姜药对（黄连12.5 g、干姜12.5 g）及其单味药（黄连、干姜各25 g），加10 倍纯水回流提取2 次（1 h／次），提取温度100 ℃，合并2 次滤液，过滤、浓缩至50 mL（质量浓度0.5 g／mL）；利巴韦林100 mg，用纯水稀释至10 mL（质量浓度10 mg／mL）。

2.1.2 药物对RD 细胞毒性的测定 黄连⁃干姜药对、黄连、干姜和利巴韦林药液过0.22 μm 微孔滤膜，用MEM培养液倍比稀释，并加到已长满RD 细胞的24 孔培养板（重复3 个复孔，每孔1 mL），同时设置正常细胞对照组，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，观察CPE，确定各药液的最大无毒浓度。

2.1.3 药物对EV71 感染RD 细胞模型病毒载量的影响100 μL 100 TCID50的EV71 加到已长满RD 细胞的24 孔板，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养1 h 后，PBS 洗2 次，分别加入各药液最大无毒浓度（重复3 个复孔，每孔1 mL），并同时设正常细胞对照组和病毒对照组，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，24 h 后终止培养，观察CPE，于－80℃冻存，解冻后提核酸，并采用RT⁃PCR 测CT 值，并计算病毒载量。

2.1.4 统计学处理 采用Excel 2010 对数据进行处理，结果以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.2 黄连⁃干姜药对的成分筛选及相关靶点靶点查询 将黄连、干姜分别输入中药系统药理学数据库TCMSP（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）中进行搜索，得到与HFMD 相关成分115 个，其中黄连32 个、干姜85 个，并获取与成分对应的靶点。

2.3 HFMD 靶点获取和药对⁃化合物⁃靶点⁃疾病网络图构建 在OMIM 数据库（http：／ ／www.omim.org／）和Gene⁃cards 数据库（https：／ ／www.genecards.org／）中搜索“Hand⁃foot and mouth disease”相关靶点。用R 3.6.2 和Cy⁃toscape 3.7.2 分别构建药对靶点和HFMD 靶点vene 图和药对⁃成分⁃靶点⁃HFMD 网络图。

2.4 蛋白质⁃蛋白质相互作用（PPI）网络图构建 交集靶点导入String 数据库（https：／ ／string⁃db.org／cgi／input.pl⁃sessionId＝H6GfU4n40mOM＆input_ page_ show_ search ＝on）中分析，结果用Cytoscape 3.7.2 做PPI 网络图。

2.5 GO 富集和KEGG 通路分析 交集靶点导入DAVID 数据库（https：／ ／david.ncifcrf.gov／summary.jsp）进行GO富集和KEGG 通路分析。

2.6 分子对接进行活性成分筛选 EV712A 和3C 蛋白酶均是由EV71 编码的半胱氨酸蛋白水解酶，2A 蛋白酶可加速多聚蛋白水解为前体蛋白，3C 蛋白酶可将前体蛋白切割为成熟结构蛋白和非结构蛋白［9］。因此2A 和3C 蛋白酶在EV71 感染宿主至关重要，成为筛选抗EV71 药物的重要靶点［10］。从RSCB PDB 数据库（http：／ ／www.rcsb.org／）下载EV712A 蛋白酶（PDB ID：4FVB［11］）和3C 蛋白酶（PDB ID：3SJO［12］）pdb 结构，通过pymol 2.3 对蛋白进行前处理（添加氢、除水和设置活性中心），并保存为pdb格式；从TCMSP 数据库下载黄连⁃干姜药对中成分的mol2格式，然后导入Chemdraw 3D 18.1 进行能量最低处理并保存为pdb 格式，通过AutodockTool 1.5.6 将蛋白和成分转化为pdbqt 格式。用AutoDock vina 进行对接，pymol 2.3 对结果进行可视化。

3 结果

3.1 细胞实验 黄连⁃干姜药对、黄连、干姜和利巴韦林在RD 细胞的最大无毒浓度分别为1.56、0.39、25、4 mg／mL；黄连⁃干姜药对、黄连和干姜均能降低EV71 感染RD 细胞模型的病毒载量，与病毒对照组相比具有统计学意义（P＜0.05）。黄连⁃干姜药对对EV71 的抑制效果仅次于利巴韦林，远高于黄连和干姜，见表1。

表1 黄连⁃干姜药对及其单味药对EV71 感染RD 细胞模型病毒载量的影响（n＝3）

3.2 黄连⁃干姜药对的成分筛选 通过TCMSP 数据库检索黄连⁃干姜药对成分198 种，其中与HFMD 相关成分115种，涉及黄连32 种、干姜83 种。

3.3 药对靶点和疾病靶点vene 图和药对⁃化合物⁃靶点⁃疾病网络图 在OMIM 数据库中搜索HFMD 相关基因522 个，Genecards 数据库中搜索HFMD 相关基因4 081 个。HFMD基因与和黄连⁃干姜药对基因取交集，获得87 个基因，绘制药对靶点和疾病靶点vene 图，见图1。Cytoscape 3.7.2绘制药对⁃化合物⁃靶点⁃疾病网络图，图中共有634 条边和205 个节点，其中化学成分115 个、靶点87 个、黄连和干姜共2 个、HFMD1 个，见图2。

图1 黄连⁃干姜药对靶点和HFMD 靶点vene 图

图2 黄连⁃干姜药对⁃化合物⁃靶点⁃HFMD 网络图

3.4 PPI 网络图 用Cytoscape 3.7.2 做PPI 网络图，图中有85 个关联靶蛋白和837 条边（颜色越深表示与其他靶蛋白关联越强）。与其他蛋白关联最强的前4 位靶点依次为INS、TP53、IL6 和MYC，见图3。

3.5 靶点通路分析 在DAVID 数据库中，GO 富集分析筛选得到GO 条目334 条（P＜0.05），涉及生物过程（BP）240 条、细胞组成（CC）37 条、分子功能（MF）56 条，选取BP、CC 和MF 各自的前20 条做柱状图，见图4；KEGG 通路富集分析筛选得到69 条信号通路（P＜0.05），涉及癌症、PI3K⁃Akt、p53、Apoptosis 和Toll⁃like receptor 等多条信号通路，见图5。

图4 黄连⁃干姜药对作用靶点的GO 富集分析BP、CC 和MF 各自前20 条通路柱状图

图5 黄连⁃干姜药对作用靶点的KEGG 通路分析前60 条通路柱状图

3.6 分子对接结果 运用AutoDock Vina 将黄连⁃干姜药对所含成分与EV712A 和3C 蛋白酶分别进行对接，并按所得结合自由能（affinity）从低到高进行排序，与2A 蛋白酶和3C 蛋白酶结合自由能最低的前10 位单体，见表2～3。由图6 可知，银杏双黄酮与2A 蛋白酶的氨基酸残基HIS⁃21、THR⁃126 和ASN⁃129 形成常规氢键，与SER⁃87 形成碳氢键，与GLU⁃85、GLY⁃128 和PRQ⁃107 形成酰胺键，与LEU⁃131，VAL⁃84 和GLY⁃127 形成π⁃烷键；老鹳草素与2A 蛋白酶的氨基酸残基HIS21、SER⁃87 和GLY⁃108 和GLY⁃127 形成常规氢键，与HIS⁃21 形成π⁃π 键。由图7 可知，老鹳草素与3C 蛋白酶的氨基酸残基GLY⁃164、THR⁃142、HIS⁃161、CYS⁃147、CLN⁃22 和HIS⁃40 形成常规氢键，与CYS⁃147 和SER⁃128 形成碳氢键，与CYS⁃147 形成π⁃硫键。异银杏双黄酮与3C 蛋白酶的GLY⁃164、GLY⁃145、HIS⁃24、GLN⁃42 和ARG⁃39 形成常规氢键，与LEU⁃127、HIS⁃40 和CYS⁃147 分别形成π⁃烷键、π⁃π 键和π⁃硫键（常规氢键绿色表示、碳氢键白色表示，酰胺键红色表示、π 类键（π⁃烷键、π⁃π 重叠键、硫⁃π 键）淡紫色表示）。这些键使活性成分与蛋白酶紧密结合，从而使2A 和3C 蛋白酶失去活性。

图6 银杏双黄酮和老鹳草素与2A 蛋白酶的结合模式

图7 老鹳草素和异银杏双黄酮与3C 蛋白酶的结合模式

表2 黄连⁃干姜药对所含成分与2A 蛋白酶的对接得分最低的前十位化合物

4 讨论

近年来，HFMD 的发病率和致死率在我国呈不断上升趋势［13］。Yamayoshi、Liu 发现EV71 可通过多条途径感染宿主细胞［14⁃15］，一两种受体阻断药无法完全阻断其感染。寻找具有多靶点的新药已成为国内外研究的新趋势。本文运用细胞实验、网络药理学和分子对接研究黄连⁃干姜药对治疗HFMD 的靶点、机制和活性成分，为多靶点治疗HFMD 新药研发提供参考。

表3 黄连⁃干姜药对所含成分与3C 蛋白酶对接得分最低的前十位化合物

细胞实验显示，黄连⁃干姜药对及其单味药均可抑制EV71 在RD 细胞中复制，黄连⁃干姜药对的药效远高于其单味药，体现出中药寒热配伍的合理性。

网络药理学得到与HFMD 基因相关的黄连⁃干姜药对成分115 种，潜在靶点87 个，GO 富集、KEGG 通路分析分别得到333、69 条。核心靶点包括TP53 和IL6 等，P53（TP53 编码的抑癌蛋白）可直接调控与干扰素通路相关的多个基因（IRF9［16］、IRF5［17］和ISG15［18］）表达，促进干扰素产生，进而发挥先天性抗病毒作用；IL⁃6 是内源性炎症介质，既可对炎症进行双向调节，激活炎症反应［19］，又可诱导B 和T 淋巴细胞分泌抗体发挥免疫作用，从而参与宿主的防御应激［20］。GO 功能分析涉及炎症反应、MAPK激酶级联反应、细胞凋亡和信号传导等多个生物过程。KEGG 通路分析涉及PI3K⁃Akt、p53、NF⁃κB、Apoptosis、Toll⁃like receptor 等通路。EV71 可促使宿主细胞活性氧的积累，影响PI3K⁃Akt［21］、NF⁃κB［22］、Toll⁃like receptor［23］等多条信号通路，促使干扰素释放和炎症因子表达；EV71 也可激活PI3K⁃Akt［24］、P53［25］等通路影响细胞凋亡，从而发挥强大的抗EV71 作用；

2A 蛋白酶活性中心由HIS⁃21、ASP⁃39 和CYS⁃110 组成［26］；3C 蛋白酶活性中心由HIS⁃40、GLU⁃71 和CYS⁃147组成［27］。分子对接表明，老鹳草素与2A 蛋白酶的HIS⁃21形成氢键和π⁃π 键；与3C 蛋白酶的HIS⁃40 形成氢键和CYS⁃147 形成氢键和π⁃硫键，从而抑制2A 和3C 蛋白酶的活性。实验研究也发现老鹳草素既可抑制EV71 在RD 细胞中复制，又可缓解感染EV71 小鼠的临床症状和降低小鼠肌肉组织中的病毒载量，从而降低小鼠死亡率［28］；银杏双黄酮和异银杏双黄酮是一种天然的黄酮类蛋白抑制剂［29］，银杏双黄酮可与EV71 2A 蛋白酶的HIS⁃21 形成氢键和π⁃π键，从而抑制2A 蛋白酶的活性，研究发现银杏双黄酮具有较强的抗病毒作用，对疱疹病毒（HSV⁃1 和HSV⁃2）［30］和流感病毒（H1N1 和H3N2）［31］均具有抑制作用；异银杏双黄酮可与EV71 3C 蛋白酶的HIS⁃40 形成π⁃π 键和CYS⁃147 形成π⁃硫键，从而抑制3C 蛋白酶的活性，研究表明异银杏双黄酮对杜氏利什曼原虫、锥体虫和金黄色葡萄球菌等感染均具有抑制作用［32］。

本文运用细胞实验、网络药理学和分子对接对黄连⁃干姜药对治疗HFMD 的靶点、机制和活性成分进行预测，结果表明黄连⁃干姜药对可通过多成分、多靶点和多通路协同治疗HFMD。由于网络药理学和分子对接的局限性，后期可通过细胞和动物实验深入研究黄连⁃干姜药对治疗HFMD的靶点、机制和活性成分。