松茸水提物提取工艺优化及其单糖组成分析

李祯鑫黄 真程汝滨钟晓明

（浙江中医药大学，浙江 杭州310053）

松茸主要分布在吉林、云南、四川、西藏等地［1⁃2］，含有多糖、多酚、麦角甾醇、挥发性有机化合物等大量活性成分［3⁃4］，近年来由于其所含多糖具有较高的药用价值而受到广泛关注［5］。研究表明，来自松茸子实体的水溶性松茸多糖是该药材主要有效物质之一，具有良好的药理活性，如抗肿瘤［6⁃7］、免疫调节［8］、抗氧化［9］，并可通过抑制人体内黑色素瘤细胞生成黑色素来起到美白肌肤的效果［10］，在化妆品领域有着的广阔的开发前景。

目前，松茸尚未被《中国药典》 收录，其质量标准的缺乏制约了该药材及其相关制剂的开发利用。因此，本实验参考文献［11⁃13］ 报道的方法，采用正交试验优化松茸水提物提取工艺，并通过柱前衍生化HPLC 法分析其单糖组成，以期为该药材后续开发和质量标准建立提供依据。

1 材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪（配置Waters 1525 二元泵、Waters 2489 紫外检测器、Waters 2707 自动进样器、Empower 2 工作站，美国Waters 公司）；DZF 数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；AL104 电子天平［梅特勒⁃托利多仪器（上海）有限公司］；KQ⁃300DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE⁃52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；UV⁃1800 紫外分光光度计（日本岛津公司）；离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）。

1.2 试剂与药物 松茸于2018 年采自云南香格里拉，经浙江中医药大学药学院中药鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定为口蘑科口蘑属真菌松茸Tricholoma matsutake。葡萄糖（批号S10S9I69833）、甘露糖（批号A16O6L4546）、半乳糖（批号Z22J9H64187）、木糖（批号B02M6W1）、岩藻糖（批号M23F8K29918）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司；1⁃苯基⁃3⁃甲基⁃5⁃吡唑啉酮（批号K1820098）购于阿拉丁试剂（上海）有限公司；磷酸二氢钾（批号20181207）购于国药集团化学试剂有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取葡萄糖对照品5.74 mg，置于25 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取2.5 mL，置于5 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（终质量浓度为114.8 μg／mL）。

2.1.2 供试品溶液制备 称取药材粉末（过50 目筛）0.5 g，置于50 mL 圆底烧瓶中，室温下4 000 r／min 离心10 min，取上清液，置于100 mL 量瓶中，加水定容，即得。2.1.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65 mL，置于10 mL 试管中，加水至1 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL 浓硫酸，摇匀，沸水浴20 min，冷却至室温，在490 nm 波长下检测吸光度。以多糖提取率为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝0.009 5X－0.001 1（r＝0.999 5），在17.22～74.62 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.4 正交试验 在前期单因素试验及方法学考察基础上，选择提取温度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）作为影响因素，多糖提取率作为评价指标（Y），L9（34）正交试验优化提取工艺，因素水平见表1。精密称定药材粉末3 份，每份0.5 g，置于圆底烧瓶中进行回流提取，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

表3 方差分析

由此可知，各因素影响程度依次为D＞A＞B＞C，除提取次数（P＜0.05）外各因素均无明显影响。最终确定，最优工艺为药材加入50 倍量水，在90 ℃下回流提取2 h，重复3 次。

2.1.5 验证试验 精密称定3 份药材粉末，每份2.0 g，按优化工艺进行提取，测得提取率分别为17.53%、17.48%、17.32%，平均17.44%，RSD 为0.63%，表明该工艺稳定可行。

2.2 单糖组成分析

2.2.1 色谱条件 Waters Xbridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相25 mmol／L 磷酸盐缓冲液（A）⁃乙腈（B），梯度洗脱（1～10 min，18% B；10～12 min，18%～20% B；12～60 min，20% B）；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长250 nm；进样量5 μL。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取对照品甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖10.19、25.14、11.82、3.22、2.70 mg，置于1 mL 量瓶中，加水定容，分别精密吸取500、350、350、150、300 μL，置于2 mL 容量瓶中，加水定容，即得。

2.2.3 粗多糖制备 精密称取药材提取物5.00 g，热水溶解，加4 倍量无水乙醇沉淀，4 ℃下静置过夜，4 000 r／min离心10 min，弃去上清液，沉淀干燥，即得，性状为棕褐色固体粉末，质量为0.894 6 g。

2.2.4 供试品溶液制备 精密称取粗多糖10.0 mg，置于5 mL量瓶中，加水定容，精密吸取1.0 mL 至5 mL 试管中，加入4 mol／L 三氟乙酸1.0 mL，橡胶塞密封，110 ℃下加热4 h，冷却至室温，置于真空干燥箱中干燥，1.0 mL 甲醇吹洗试管，干燥，重复3 次，200 μL 蒸馏水复溶，即得。

2.2.5 PMP 衍生化 取水解后的供试品溶液200 μL，加入0.5 mol／L PMP 甲醇溶 液、0.3 mol／L NaOH 溶液各200 μL，充分溶解后移至2 mL 离心管中，70 ℃水浴加热100 min，冷却至室温，加入0.3 mol／L HCl，充分混匀，加入1.0 mL 三氯甲烷充分振荡，取上清液，重复3 次，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.6 方法学考察

2.2.6.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液700、550、400、250、100 μL，置 于1 mL 量瓶中，加水定 容，按“2.2.5”项下方法衍生化，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以各单糖质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表4，可知均在各自范围内线性关系良好。

表4 各单糖线性关系

2.2.6.2 精密度试验 取对照品溶液，按“2.2.5”项下方法衍生化，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖峰面积RSD 分别为1.26%、0.76%、0.97%、1.04%、0.65%，表明仪器精密度良好。

2.2.6.3 稳定性试验 精密称取粗多糖，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.5”项下方法衍生化，于0、2、4、8、16 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖峰面积RSD分别为1.13%、2.41%、1.21%、1.48%、1.31%，表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.2.6.4 重复性试验 精密称取粗多糖6 份，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.5”项下方法衍生化，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖峰面积RSD 分别为2.48%、2.13%、2.31%、1.73%、2.11%，表明该方法重复性较好。

2.2.6.5 加样回收率试验 精密称取各单糖含量已知的粗多糖6 份，精密加入等同于样品量的对照品溶液，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.5”项下方法衍生化，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖平均加样回收率分别为100.37%、95.21%、101.89%、103.78%、97.71%，RSD 分别为1.38%、2.14%、1.95%、1.72%、2.72%。

2.2.7 分析结果 精密称取粗多糖3 份，每份10.0 mg，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.5”项下方法衍生化处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。结果显示，多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖组成，摩尔比为1 ∶3.39 ∶1.19 ∶0.24 ∶0.40，其中葡萄糖、半乳糖、甘露糖质量占比较高，分别为55.12%、19.41%、16.28%。HPLC 色谱图见图1。

图1 各单糖HPLC 色谱图

3 讨论

3.1 提取工艺选择 陈炼红［14］等采用响应面法优化松茸多糖复合酶法提取工艺，但其最终提取率仅为6.95%，而工艺条件要求高，成本昂贵，工业化生产限制较多。本实验采用热回流法优化提取工艺，条件温和，操作简单，松茸水提物中多糖提取率可达17.44%，适用于工业化大规模生产。

3.2 色谱条件选择 在水相中加入适量缓冲盐时，能改善单糖衍生物的HPLC 色谱图峰型，故本实验考察了乙酸铵、磷酸盐缓冲系统，结果发现，乙酸铵缓冲系统虽然在pH为5.5 左右时可使峰型对称，拖尾程度降低，但存在缓冲盐用量大、水相易霉变、出峰时间不稳定等诸多问题，故选用磷酸盐缓冲系统，此时拖尾因子小，出峰稳定，分离度好，适用于XBridge C18柱对单糖衍生物的分析。

3.3 单糖组成分析 刘刚［15］等初步确定，松茸多糖由葡萄糖、木糖和半乳糖组成；高瑞希［16］等发现，松茸多糖含有木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸。本实验采用PMP 柱前衍生化HPLC 法分析松茸多糖的单糖组成，发现其中同时存在甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，并首次建立同时对上述5 种单糖进行定量测定的方法，可用于松茸及其相关制剂的质量控制。

4 结论

本实验对松茸水提物提取工艺及单糖组成进行了系统研究，先采用正交试验优化提取工艺，再通过PMP 柱前衍生化HPLC 法分析单糖组成，发现有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖5 种，摩尔比为1 ∶3.39 ∶1.19 ∶0.24∶0.40。而且，该方法准确度和精密度良好，灵敏度高，操作简便，可用于松茸多糖组成分析，也可为其他药材的相关研究提供参考依据。