大叶小檗根提取工艺的优化

丘 露曲 帅阚 鸿*唐 姗包海鹰王英平

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春130118； 2.吉林省生物研究所药用真菌研究室，吉林 长春130012）

大叶小檗性味苦寒，归肝、胃、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，内服治疗细菌痢疾、肠胃炎、副伤寒、消化不良、黄疸、肝硬化腹水、泌尿系感染、急性肾炎、扁桃体炎、口腔炎、支气管炎，外用治疗中耳炎、目赤肿痛、外伤感染等［1⁃2］。现代药理研究表明，小檗碱是从传统中药黄连、黄柏中提取出的一种异喹啉类生物碱，在我国拥有悠久的药用历史，有着抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、心脏保护、降血糖、调节脂质代谢、免疫抑制等多种药理作用［3］。

黄柏因其显著的药理价值，已被广泛用于开发中成药及保健品，尤其是以小檗碱为主要成分开发了很多相关医药产品，但其种植周期长，需要20 年左右才能达到采收的要求，造成市面上资源紧缺，价格不断攀升，给企业生产带来了压力［4］。为了解决黄柏资源短缺和市场需要的矛盾，需寻找同科属中研究较少、药理活性相似的植物，本实验选择大叶小檗根作为研究对象。

前期报道，大叶小檗全株含有生物碱，而其根含大量小檗碱及掌叶防己碱、古伦胺碱、药根碱、刺檗碱，其中小檗碱为主要有效成分之一［5⁃7］。目前，针对盐酸小檗碱提取工艺的研究较多，常用方法有酸水提取、酸水渗漉、乙醇回流提取、微波提取、超声波辅助提取等［8⁃10］。近年来，国内外对大叶小檗根抗炎、抗肿瘤作用已有报道［11］，但对其所含成分盐酸小檗碱提取工艺涉及较少，为了更好地开发利用该部位，本实验选择浸膏得率、盐酸小檗碱提取率的权重和作为评价指标［12⁃13］对其提取工艺进行优化，以期为进一步相关开发利用奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 ACQUITY 型超高压液相色谱仪（美国Waters公司）；PH 计（瑞士Mettler⁃Toledo 公司）；LD5⁃2A 型台式低速离心机（北京京立离心有限公司）；KQ⁃300ES 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；BT125D 电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；HH⁃S28s 型数显恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）。

1.2 试剂与药物 大叶小檗根采自吉林临江大叶小檗基地，经吉林农业大学包海鹰教授鉴定为小檗科植物大叶小檗Berberis amurensisRupr.的根。盐酸小檗碱对照品（CAS＃633⁃65⁃8，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）。磷酸二氢铵［CAS7722⁃76⁃1，阿拉丁试剂（上海）有限公司］；磷酸（批号20121121，天津市光复精细化工研究所）；乙腈为色谱纯（赛默飞世尔科技有限公司）；甲醇（批号20180711）、乙醇（批号20181008）、盐酸（批号20121225）为分析纯（北京化工厂）；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 精密称取干燥至恒重的药材粉末2.003 g，加入一定体积分数乙醇（含0.12 mol／L HCl），50 ℃下超声（40 kHz、80 kW）提取30 min，冷却至室温，乙醇（含0.12 mol／L HCl）补足减失的质量，离心（4 000 r／min）10 min，取上清液，既得。

2.2 浸膏得率测定 按“2.1”项方法制备供试品溶液，精密量取上清液，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，100 ℃下干燥至浸膏状，置于干燥器中冷却至室温，精密称定质量，计算浸膏得率。

2.3 小檗碱含量测定

2.3.1 色谱条件 参考文献［14⁃16］ 报道。Waters AC⁃QUITY UPLC® BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.01 mol／L 磷酸二氢铵（B）（磷酸调节pH 至2.8），梯度洗脱（0～10 min，10%～20% A；10～10.1 min，20%～50% A；10.1～14 min，50% A；14～14.01 min，50%～10%A；14.01～16 min，10%A）；体积流量0.5 mL／min；检测波长345 nm；柱温35 ℃；进样量2 μL，色谱图见图1。由此可知，供试品溶液中各成分分离度良好，杂质无干扰。

图1 盐酸小檗碱UPLC 色谱图

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品，甲醇溶解定容至刻度，即得（质量浓度为1 mg／mL），置于冰箱中保存备用。

2.3.3 线性关系考察 吸取“2.3.2”项下对照品溶液，甲醇依次稀释至10、20、40、60、80 μg／mL，在“2.3.1”项色谱条件下各进样2 μL 测定。以盐酸小檗碱质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝33 729X＋51 471（r＝0.999 1），在10～80 μg／mL范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 取同一份对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得盐酸小檗碱峰面积RSD为0.18%，表明仪器精密度较好。

2.3.5 重复性试验 取同一批药材粉末6 份，按“2.1”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得盐酸小檗碱峰面积RSD 为1.73%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一批药材粉末，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1”项色谱条件下各进样2 μL 测定，测得盐酸小檗碱峰面积RSD 为0.70%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.7 加样回收率试验 取“2.1”项下供试品溶液9 份，随机分成3 组，每组分别精密加入低、中、高质量浓度的对照溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，盐酸小檗碱平均加样回收率为106%，RSD为0.511%。

2.4 提取工艺优化

2.4.1 提取方法筛选 固定料液比、提取溶剂，以浸膏率、盐酸小檗碱提取率的综合评分（浸膏率×50%＋盐酸小檗碱提取率×50%）为评价指标，考察超声提取、超声加酸提取、回流提取、浸渍提取方法的效果，结果见表1。由此可知，超声加酸提取效率较高，故选择其作为提取方法。

表1 提取方法筛选结果

2.4.2 单因素试验 采用超声加酸提取，筛选乙醇（含0.12 mol／L HCl）体积分 数、料液比、提取时 间，按“2.1”项下方法制备供试品溶液进行考察，结果见图2。由此可知，乙醇（含0.12 mol／L HCl）体积分数在0～50%范围内时提取率增加缓慢，在50%～70%范围内增加较快，随后又逐渐减缓，故选择50%～90% 进行考察；料液比在1 ∶10～1 ∶30 范围内提取率增加缓慢，在1 ∶30～1 ∶50 范围内增加较快，在1 ∶50～1 ∶100 范围内趋于缓和，故选择1 ∶30～1 ∶50 进行考察；提取时间30 min 时提取率最高，故选择15～45 min进行考察。

图2 单因素试验结果

2.4.3 析因设计 以乙醇（含0.12 mol／L HCl）体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）为影响因素，浸膏率、盐酸小檗碱提取率的综合评分（Y）为评价指标，采用析因设计进行筛选，结果见表2，方差分析见表3。由表3 可知，乙醇（含0.12 mol／L HCl）体积分数有极显著影响（P＜0.01），提取时间有显著影响（P＜0.05），料液比无显著影响（P＞0.05），故将料液比确定为1 ∶50，进一步对其他2 种因素进行优化。

表2 析因设计结果

表3 析因设计方差分析

2.4.4 最速上升试验 参考文献［17］ 报道。由于乙醇（含0.12 mol／L HCl）体积分数（A）、提取时间（B）有显著影响（P＜0.05），故按两者效应比例设定路径和步长，以浸膏率、盐酸小檗碱提取率的综合评分（Y）为评价指标，确定基本步长分别为10%、5 min，结果见表4。由此可知，乙醇（含0.12 mol／L HCl）体积分数80%、提取时间35 min 时的综合评分最高，故将其作为中心组合设计⁃响应面法的中心试验点。

表4 最速上升试验结果

2.4.5 中心组合设计⁃响应面法 参考文献［18⁃20］ 报道。以浸膏率、盐酸小檗碱提取率的综合评分（Y）为评价指标，对“2.4.4”项下中心试验点进行处理，因素水平见表5，结果见表6。

表5 中心组合设计⁃响应面法因素水平

表6 中心组合设计－响应面法结果

采用Design Expert 软件对表6 数据进行多元二次回归拟合，得方程为Y＝0.17＋7.714×10－3A＋2.789×10－3B－4.5×10－4AB－5.169×10－3A2－0.013B2（R2＝0.939 5），表明模型拟合度较高，方差分析见表7。由此可知，模型具有极显著影响（P＜0.01）；因素A、B2有极显著影响（P＜0.01），A2有显著影响（P＜0.05）。

表7 中心组合设计⁃响应面法方差分析

响应面分析见图3。由此可知，因素A达到85%左右时曲面变缓，等高线密度变疏，表明它在取值较小时对响应面值影响明显；因素B达到35 min 左右时曲面变缓，等高线密度变疏，表明它在取值较小时对响应面值影响明显。

图3 各因素响应面图

2.5 验证试验 采用Design Expert 软件，得到最优工艺为乙醇（含0.12 mol／L HCl）体积分数87.42%，提取时间35.49 min，料液比1 ∶50，综合评分0.170 5，考虑到实际情况，将其修正为乙醇（含0.12 mol／L HCl）体积分数90%，提取时间35 min，料液比1 ∶50。按照优化工艺进行3 批验证试验，测得综合评分为0.169 4（浸膏率、盐酸小檗碱得率分别为32.483 0%、1.403 1%），与预测值0.170 5接近，表明该工艺稳定可行。

3 讨论

由于生物碱类化合物具有多种生物活性，也是中药材中重要药效成分，故研究其提取优化条件对于科研和生产具有重要意义。目前，生物碱提取工艺优化主要考察醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度、pH 值等指标［21⁃22］，设计方案采用正交试验［23］、Box⁃Behnken 响应面法［24］、星点设计⁃效应面法［25］。

本实验采用析因设计、最速上升实验、中心组合设计⁃响应面法结合的方法，优化大叶小檗提取工艺。其中，析因设计的最大优点是所获得的信息量很多，可准确地估计各试验因素主效应大小，不仅可用来分析全部因素的主效应、各因素之间的交互作用，还能有效控制或消除其它混杂因素对反应变量的干扰，使结果更准确、可靠、稳定，从而为选择最优处理组合提供依据；最速上升法是以梯度方向为搜索方向求极大值的优化方法，通过寻求最优步长来使在该方向的目标函数值最大；中心组合设计⁃响应面法的最大优点是能克服正交设计和均匀设计预测性较差、精确度不高的缺点，通过非线性模型拟合来预测最佳试验条件，使工艺得到最大程度的优化，将三者有机结合时，可首先筛选显著影响因素，再根据合理的梯度、设计预测来拟合非线性模型，从而得到更为准确、可靠的最佳实验条件。

本实验发现，各提取方法权重和依次为超声加酸提取＞回流提取＞超声提取＞浸渍提取，故选择超声加酸提取作进一步考察。析因设计显示，乙醇体积分数（含0.12 mol／L HCl）对实验结果有极显著影响，而提取时间有显著影响。根据函数梯度的特性发现，在试验点附近沿梯度方向函数变化率最大，即80%乙醇（含0.12 mol／L HCl），提取时间35 min，故将其作为响应面试验的中心试验点。最终确定，大叶小檗根最优提取工艺为提取时间35 min，提取溶剂90%乙醇⁃0.12 mol／L HCl，料液比1 ∶50，并且所得预测值与实测值的相对偏差较小，可为该药材开发利用奠定理论基础。