不同产地薏苡仁HPLC 指纹图谱建立及甘油三油酸酯测定

张 婷罗云云杜伟锋*葛卫红李昌煜

（1.杭州市西溪医院，浙江 杭州310023； 2.浙江中医药大学中药炮制技术研究中心，浙江杭州311401；3.浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州310052； 4.浙江中医药大学中医药科学院，浙江 杭州310053）

薏苡仁为禾本科植物薏苡Coix lacrma⁃jobiL.var.mayuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟种仁［1］，性凉，味甘淡，归脾、肺、胃经，具有健脾渗湿、清热排脓、除弊、利水等功效［2⁃3］。其主要成分有甘油三酯类、多糖类、氨基酸及生物碱类等［4］。现代研究表明，薏苡仁可应用于消化系统肿瘤［5］、胃肠功能紊乱［6］、类风湿性关节炎［7］等。薏苡仁为药食同用的品种［8］，市场需求量大。在各地均有生长分布，以贵州、福建等为主产地。由于各产区种植方法和气候条件的不同，造成其成分质量差异［9］，从而导致薏苡仁临床疗效的差异，因此对不同产地薏苡仁质量进行更全面的评价，以期有利于优化产地，保证相关产品的质量。

目前，中药HPLC 指纹图谱用于分析中药有效成分的种类和含量，符合中医中药整体性和模糊性的特点，已逐渐应用于中药质量控制和评价中［10⁃12］。为了仔细分析不同产地薏苡仁的质量差异，本研究对4 个主要产地（贵州、福建、浙江、云南）11 批薏苡仁进行指纹图谱相似度评价及聚类分析，同时检测其指标成分甘油三油酸酯的含量，比较样品质量差异，以期为薏苡仁最优产地的选择提供依据。另外，为更准确反应产地真实情况，实验样品均为实地调研采样所得，经统一的加工方法处理。

1 材料

戴安3000 高效液相色谱仪（美国Dionex 公司）；LNN ELSD 3000 型蒸发光散射检测器（美国LNN 公司）；DFT⁃200 手提式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；Al⁃204 型电子分析天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）。乙腈、二氯甲烷均为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。甘油三油酸酯标准物质（纯度99.8%，批号111692⁃201605）。

本研究共选取了贵州、福建、浙江、云南出产的薏苡仁共11 批样品，信息见表1，经浙江中医药大学葛卫红教授鉴定均为正品。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 安捷伦反相C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈⁃二氯甲烷（65 ∶35）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃。蒸发光散射检测器检测［13］；载气体积流量2.0 L／min；漂移管温度70 ℃；保留时间50 min；增益2。

2.2 供试品溶液制备 取薏苡仁粉末（过3 号筛）约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 mL，称定质量，浸泡2 h，超声（300 W、50 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用流动相补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液制备 取甘油三油酸酯对照品适量，精密称定，加流动相制备成每1 mL 含0.14 mg该成分的溶液，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，将所得指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版”软件，计算相似度均大于0.995，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一薏苡仁供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h 时进样，记录指纹图谱，所得图谱导入软件计算得相似度均大于0.995，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批薏苡仁粉末，精密称定6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，记录指纹图谱，导入指纹图谱相似度评价系统软件，计算相似度均大于0.995，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱分析

2.5.1 指纹图谱建立 分别取不同产地薏苡仁S1～S11，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样分析，得到各批薏苡仁HPLC 色谱图，将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版”，其中保留时间稳定的共有峰有7 个，在“2.1”项色谱条件下，将薏苡仁指纹图谱与对照品色谱进行比较，指认出6 号锋主要指标成分甘油三油酸酯，将其作为参照峰，计算各共有峰与参比峰的峰面积比值，每个样品的非共有峰面积占总峰面积的比值均小于20%，符合指纹图谱要求。其中指纹图谱叠加图见图1，对照品及薏苡仁样品的共有峰模式图见图2～3。

图1 11 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of eleven batches of samples

图2 对照品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance

图3 样品共有峰模式图Fig.3 Common peak pattern of samples

2.5.2 相似度评价及聚类分析 分别将11 批样品的色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）软件，考察色谱峰相似度的一致性，进行相似度评价，结果见表2，表明不同产地11 批样品指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，虽然不同产地样品中各成分含量有较大差别，但特征指纹峰的相对保留时间一致。11 批样品中，除S3样品相似度为0.705 外，其余相似度均大于0.902。不同产地样品指纹图谱没有显著性差异，其共有峰相对保留时间基本一致，峰面积比值存在较大差异，表明不同产地样品质量之间存在差异。

表2 11 批样品相似度Tab.2 Similarities of eleven batches of samples

同时以筛选所得的7 个共有峰面积为变量，产地为自变量，应用SPSS 19.0 软件进行聚类分析，结果见图4，表明11 批样品分为3 类，Ⅰ类为S1、S2、S3、S5、S9、S10、S11，即贵州样品、1 批福建样品、1 批浙江样品及云南样品聚为一类；Ⅱ类为S4、S6、S8，即2 批福建样品与1 批浙江样品聚为一类；Ⅲ类为S7，即1 批浙江缙云县的样品单独为一类。可见贵州和云南的样品较为稳定；而3 批浙江的样品聚为3 类，2 批福建样品聚为2类，可见即使同一产地，不同种植户间的药材质量也有较大差异。

图4 11 批样品聚类分析树状图Fig.4 Dendrogram of eleven batches of samples

2.6 甘油三油酸酯含量测定

2.6.1 线性关系考察 取甘油三油酸酯对照品逐级稀释成5 个不同质量浓度梯度对照品溶液，摇匀，同时在“2.1”项色谱条件下进样，以对照品质量浓度对数值为横坐标（X），峰面积对数值为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝1.841 5X＋7.141 9（r＝0.999 3），在0.223～8.625 mg／mL 范围内线性关系良好。

2.6.2 精密度试验 精密称定甘油三油酸酯对照品适量，加入流动相制备成每1 mL 含0.25 mg 的对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，测得峰面积、保留时间RSD 分别为2.41%、0.25%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 精密称取同一批样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 各进样1次，测得峰面积、保留时间RSD 分别为1.42%、0.57%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验 取同一批样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测得峰面积、保留时间RSD 分别为2.49%、0.51%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 取同一批样品6 份，按低、中、高比例（0.5、1.0、2.0 倍）加入对照品甘油三油酸酯，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，记录各峰面积和保留时间，测得甘油三油酸酯平均加样回收率为99.84%，RSD 为1.09%。

2.6.6 样品含量测定 按“2.2”项下方法制备11 批供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL，根据外标法［14］计算各组分含量，结果见表3。除S4 样品的含量低于2020 年版《中国药典》限度值0.50% 外，其余样品均高于此限度值，其中S1 样品最高，达0.998%；产自云南曲靖师宗县的含量平均值最高，达0.911%；福建产样品质量稳定性最差，RSD 为31.37%，而浙江、云南产样品RSD 相对较低，质量较为稳定。

表3 甘油三油酸酯含量测定结果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of glycerol trioleate（%， n＝3）

3 讨论

本实验对色谱条件进行了系统性考察，包括乙腈⁃二氯甲烷流动相的不同比例（70 ∶30、68 ∶32、65 ∶35、62 ∶38、60 ∶40）、不同体积流量（0.5、0.8、1.0、1.3、1.5 mL／min）、不 同柱温（20、25、30、35 ℃），最终确定“2.1”项下色谱条件。采用HPLC⁃ELSD 法测定薏苡仁指纹图谱的同时获得甘油三油酸酯含量，该方法稳定可靠、重现性较高，可用于评价薏苡仁及其他含有甘油三油酸酯的药材的质量。而运用指纹图谱结合相似度分析和聚类分析，以及以甘油三油酸酯的含量作为指标，可对不同产地薏苡仁的质量进行更为全面的评价。

结果表明，不同产地的薏苡仁质量存在差异，甚至来自同一省同一地区的样本之间含量也有一定差异。大部分薏苡仁种植户都是自己留种，在各地种植方法和气候条件的影响下，经过多年的人工种植，形成了一些各自不同的特征，可以解释薏苡仁中化学成分的差异。同时，实地采样调研发现福建薏苡产地加工方式差异较大，浦城产薏苡常供药用，而食用型薏苡常加工成碎米，这可能是导致福建产薏苡质量不稳定的原因。因此，为能更好确保中药的质量，在建立完善的质量标准体系的同时，还应建立中药材质量追溯系统，实时监控药材从种植到临床应用的全过程，从而确保中药疗效。