延丹胶囊对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血的作用及机制

焦 杰马星月傅 强马世平马占强

（中国药科大学，江苏 南京211198）

近年来，心血管疾病发生率逐渐上升，死亡率高达32%［1］，其中心肌缺血是引起心绞痛、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病的主要原因［2⁃4］，其临床症状大多表现为心慌、胸闷或胸痛，常用药物有抗血小板药、β 受体阻断剂、钙离子拮抗剂等，但长期服用西药容易产生不良反应，故研发相关中药逐渐成为趋势。异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血损伤模型为研究心肌缺血经典模型之一［5］，大剂量该药物通过自由基急速生成和聚集，会导致心肌缺血缺氧而形成模型［6］。延丹胶囊为活血化瘀、理气止痛的中成药之一，临床上广泛用于治疗冠心病劳累性心绞痛气滞血瘀证，但其机制尚不明确，本实验考察该制剂对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血损伤的改善作用及机制，以期为其临床合理应用提供指导。

1 材料

1.1 试剂与药物 延丹胶囊［天长亿帆制药有限公司，批号190602，主要组方药材为丹参、延胡索（醋制）、五灵脂、瓜蒌、乳香（醋制）、白芍、枳壳和柴胡］；通心络胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，批号A1811042）；盐酸异丙肾上腺素（美国Sigma 公司，批号WXBC9656V）；生理盐水注射液（安徽双鹤药业有限责任公司，批号17011903C）。水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号20160705）；甲醛（西陇科学股份有限公司，批号1908032）；MDA（批号20191030）、T⁃SOD（批号20191030）、AST（批号20191031）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；HIF⁃1α检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批 号 2ENRG14UI4 ）；IL⁃1β（批 号E20191001A）、TNF⁃α（批号E20191001A）检测试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司）；Nrf2 抗体（货号16396⁃1⁃AP）、HO⁃1 抗体（货号10701⁃1⁃AP）、GAPDH 抗体（货号10494⁃1⁃AP）（武汉三鹰生物技术有限公司）；p53 抗体［圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司，货号sc⁃126］；Bcl⁃2抗体（货号ab59348）、Bax 抗体（货号ab32503）［艾博抗（上海）贸易有限公司］。

1.2 动物 SPF 级SD 大鼠60 只，雌雄各半，体质量（200±20）g，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物生产许可证号SCXK（苏）2017⁃0001，在标准实验条件下［温度（25±2）℃、相对湿度（60±5）%］ 适应性饲养1 周后随机分组，正常昼夜节律，自由进食饮水。

1.3 仪器 BL⁃420N 生物信号采集与分析系统（成都泰盟软件有限公司）；电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；全波长酶标仪（美国Thermo 公司）；KD⁃BM 生物组织包埋机（北京世纪科信科学仪器有限公司）；RM2235 切片机（德国Leica 公司）；BX53 正置生物显微镜（日本Olympus 公司）；EPS600 电泳仪、全自动数码凝胶／化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；Western blot 转膜仪（美国Bio⁃Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模及给药 60 只大鼠随机分为空白组，模型组，通心络胶囊组（200.57 mg／kg）及延丹胶囊低、中、高剂量组（154、308、616 mg／kg），其中延丹胶囊中剂量组为临床用量（人与大鼠等效剂量换算比例为1 ∶6），连续灌胃给药8 d，剂量均为1 mL／100 g（空白组、模型组大鼠给予等量的生理盐水）。第6～8 天给药30 min 后，除空白组外其余各组大鼠腹腔注射40 mg／kg 异丙肾上腺素，连续3 d，用于构建急性心肌缺血模型（空白组大鼠腹腔注射等量生理盐水）。

2.2 大鼠心电图监测 第6 天灌胃给药30 min后，10%水合氯醛麻醉大鼠，空白组大鼠腹腔注射生理盐水，其余各组大鼠腹腔注射40 mg／kg 异丙肾上腺素，并立即行肢体Ⅱ导联心电图检查，记录ST 段变化。

2.3 大鼠血清因子检测 第8 天灌胃给药30 min后，沿大鼠腹部正中线切开，打开腹腔，腹主动脉采血至无菌试管中，静置30 min 后3 000 r／min 离心15 min，分离血清，采用全波长酶标仪检测MDA、T⁃SOD、AST、HIF⁃1α、TNF⁃α、IL⁃1β 水平，严格按照相应试剂盒说明书中的方法进行操作。

2.4 大鼠心肌组织病理学检查 第8 天灌胃给药30 min 后，沿大鼠腹部正中线切开，打开胸腔，取出心脏，选取左心室组织，置于装有10% 甲醛溶液的离心管中固定48 h，HE 染色观察心肌组织病理变化。

2.5 大鼠心脏组织相关蛋白表达检测（Western blot 法）称取200 mg 大鼠左心室组织，加入液氮，在研钵中充分研磨，加入裂解液充分混匀，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r／min 离心30 min，取上清液，BCA 试剂盒进行蛋白定量并调整浓度；蛋白变性后上样，电泳，转膜，加入一抗，4 ℃下孵育过夜，TBST 清洗后加入二抗，室温下孵育2 h，TBST 清洗，加入ECL 发光液曝光，扫描图像后通过Image J 软件进行分析，以目的蛋白灰度值／内参GAPDH 灰度值的比值为目的蛋白相对表达。

2.6 大鼠心脏组织相关蛋白表达检测（免疫组化法）各组取3 只大鼠心脏，10%福尔马林固定，经脱水、石蜡包埋后常规切片4 μm，再依次进行脱蜡、水化、抗原修复、一抗孵育、二抗孵育、苏木精核染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、晾干，在显微镜下对左心室心肌细胞进行观察并拍照，通过Image J 软件对图片进行阳性细胞率统计。

2.7 统计学分析 通过GraphPad Prism 5.01 软件进行处理，结果以（）表示，除心电图数据组间比较采用t检验外，其余数据组间比较均采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠心电图 与空白组比较，模型组大鼠ST段升高（P＜0.01）；与模型组比较，延丹胶囊各剂量组大鼠心电图ST 段降低（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 延丹胶囊对心肌缺血大鼠心电图ST 段的影响（，n＝7）Tab.1 Effect of Yandan Capsules on ST segment of myo⁃cardial ischemic rats（， n＝7）

表1 延丹胶囊对心肌缺血大鼠心电图ST 段的影响（，n＝7）Tab.1 Effect of Yandan Capsules on ST segment of myo⁃cardial ischemic rats（， n＝7）

注：与空白组比较，＃＃ P ＜0.01；与模型组比较，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.2 大鼠心肌组织病理学 空白组大鼠心肌细胞排列整齐有序，横纹清晰，无纤维结构改变，无大量炎性细胞浸润；模型组大鼠横纹断裂，心肌细胞排列紊乱，出现肌丝溶解，大量炎性细胞浸润等病理变化；延丹胶囊中、高剂量组大鼠心肌组织病变明显改善，见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化（HE，×400）Fig.1 Pathological changes of myocardial tissues of rats in various groups（HE，×400）

3.3 大鼠血清MDA、T⁃SOD、AST 水平 与空白组比较，模型组大鼠血清MDA、AST 水平升高（P＜0.01），T⁃SOD 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，延丹胶囊各剂量组大鼠血清MDA、AST水平降低（P＜0.05，P＜0.01），T⁃SOD 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），见图2。

图2 延丹胶囊对心肌缺血大鼠血清MDA、T⁃SOD、AST 水平的影响Fig.2 Effects of Yandan Capsules on serum levels of MDA，T⁃SOD and AST in myocardial ischemic rats

3.4 大鼠血清HIF⁃1α 水平 与空白组比较，模型组大鼠血清HIF⁃1α 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，延丹胶囊各剂量组大鼠血清HIF⁃1α 水平降低（P＜0.01），见图3。

图3 延丹胶囊对心肌缺血大鼠血清HIF⁃1α 水平的影响Fig.3 Effect of Yandan Capsules on serum HIF⁃1α level in myocardial ischemic rats

3.5 大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β 水平 与空白组比较，模型组大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，延丹胶囊各剂量组大鼠血清TNF⁃α 水平降低（P＜0.01），而IL⁃1β 水平虽也有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 延丹胶囊对心肌缺血大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β 水平的影响Fig.4 Effects of Yandan Capsules on serum levels of TNF⁃α and IL⁃1β in myocardial ischemic rats

3.6 大鼠心脏组织Nrf2／HO⁃1／p53 信号通路相关蛋白表达 与空白组比较，模型组大鼠心脏组织Nrf2、HO⁃1 蛋白表达降低（P＜0.01），p53 蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，延丹胶囊各剂量组大鼠心脏组织Nrf2、HO⁃1 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01），p53 蛋白表达降低（P＜0.01），见图5。

图5 延丹胶囊对心肌缺血大鼠心脏组织Nrf2／HO⁃1／p53 信号通路相关蛋白表达的影响Fig.5 Effects of Yandan Capsules on proteins associated with Nrf2／HO⁃1／p53 signaling pathway in cardiac tissues of rats with myocardial ischemia

3.7 大鼠心脏组织Bcl⁃2／Bax 蛋白表达 与空白组比较，模型组大鼠心脏组织Bcl⁃2／Bax 蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，延丹胶囊各剂量组大鼠心脏组织Bcl⁃2／Bax 蛋白表达升高（P＜0.01），见图6。

3.8 大鼠心脏组织Nrf2、p53 蛋白表达 与空白组比较，模型组大鼠心脏组织Nrf2 蛋白表达的阳性细胞率降低（P＜0.01），p53 蛋白表达的阳性细胞率升高（P＜0.01）；与模型组比较，延丹胶囊各剂量组大鼠心脏组织Nrf2 蛋白表达升高（P＜0.05），p53 蛋白表达的阳性细胞率降低（P＜0.01），见图7。

图7 延丹胶囊对心肌缺血大鼠心脏组织Nrf2、p53 蛋白表达的影响（×400）Fig.7 Effects of Yandan Capsules on Nrf2 and p53 protein expressions in cardiac tissues of rats with myocardial ischemia（×400）

4 讨论

心肌缺血临床表现多为心电图ST 段抬高，而其抬高程度可以反应心肌缺血和心肌损伤的程度，是作为评价心肌缺血程度的标志之一［7］。MDA 和SOD 作为氧化应激的主要指标，在大鼠发生心肌缺血损伤后将产生急剧变化［8］。AST 主要分布在心肌中，正常时血清的AST 水平较低，当细胞受损时，细胞膜通透性增加，胞浆内AST 释放入血。同时，伴随炎症因子的释放，心肌损伤得以进一步加剧。HIF⁃1α 在缺氧环境下稳定表达，介导组织对缺氧、低氧的适应，并在缺氧条件下维持组织和细胞的稳态［9⁃10］。其浓度与氧浓度存在密切关系，氧浓度越低，HIF⁃1α 表达越高。通过观察心肌缺血大鼠心电图ST 段的变化、心肌组织病理变化，以及MDA、AST 及炎症因子等指标水平的变化，可以发现延丹胶囊能有效的降低急性心肌缺血大鼠ST 段异常抬高，减轻心肌组织的病理损伤程度，显著降低大鼠血清MDA、AST、HIF⁃1α 和TNF⁃α水平，显著升高T⁃SOD 水平，但对血清IL⁃1β 水平并没有影响。因此，延丹胶囊对异丙肾上腺素致SD 大鼠急性心肌缺血损伤具有良好的保护作用，其作用与改善细胞氧化应激及炎症水平相关。

Nrf2 是保护细胞免受氧化应激的最主要的正向调节因子。正常条件下，Nrf2 与接头Keap1 结合形成复合物，当发生氧化应激时，Nrf2 与Keap1 解离，进入细胞核，与抗氧化反应原件（antioxidant response element，ARE）相互结合，从而激活下游基因表达［11⁃12］。其中，HO⁃1 即其经典下游之一。HO⁃1 是新近发现的一种最广泛存在的抗氧化酶，通常呈低水平表达，当受到伤害性刺激后水平明显升高，是拮抗氧化应激的关键转录因子［13］。p53／Bax／Bcl⁃2 信号通路是研究心肌缺血后细胞凋亡的经典通路之一。p53 可通过Bax／Bcl⁃2 完成对细胞凋亡的调控作用。Bcl⁃2 可阻止凋亡形成因子如细胞色素C 等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax 可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C 的释放，具有促凋亡作用，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡决定了细胞在受到一定刺激或损伤后存活或凋亡的可能性［14⁃15］。而p53 可以上调Bax 的表达水平，以及下调Bcl⁃2的表达共同完成促进细胞凋亡作用［16］。从Western blot 和免疫组化法实验结果可以看出，延丹胶囊能明显降低p53 和Bax 蛋白的表达，而显著提高Nrf2、HO⁃1和Bcl⁃2 蛋白的表达。即延丹胶囊可以通过改善氧化应激水平，发挥抗凋亡作用，从而对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血损伤具有改善作用。

综上所述，延丹胶囊对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血损伤具有良好的保护作用，其作用机制可能与抗氧化，抗炎，改善细胞凋亡等因素相关。但其作用机制复杂，有待后续进一步研究。