肝脱氧核糖核酸蛋白（DNP）溶液黏弹性对Maxwell方程拟合的研究

施永德

（复旦大学上海医学院生物物理学教研室，上海 200032）

在流变学领域关于血液的研究发表很多，而对其他组织研究发表较少[1-5]。本文拟对肝脱氧核糖核酸蛋白（DNP）的流变学进行研究，也许今后对肝癌与其他肝病防治研究有好处。此外Maxwell黏弹性方程有一百多年历史，在上世纪引入生物科学研究，但认为该方程与实验数值不符[6]。本文拟对肝DNP的黏弹性进行检测，试图用该方程进行拟合。随着细胞分子生物学发展，已公认染色质组成的染色体，是控制着细胞的分裂、生长、发育、执行细胞功能的重要物质。而染色体在光学显微镜下的染色出现与细胞周期有关，它仅出现于细胞分裂期。染色体的出现是染色质浓缩有序的筑构，其逆向是松散成为光学显微镜下不可见的染色质。研究表明染色质是DNA与蛋白质有序结合的复合物，通常称为DNP。其核心结构研究表明是由（H2A,H2B,H3,H4）2的8个聚体组蛋白及其外周缠绕的DNA双螺旋链构成的颗粒，其颗粒的DNA两头又被组蛋白H1锚联成为串珠状的结构，然后构成6个串珠一圈，直径为30 nm的超螺旋管的纤维结构，继之又由纤丝聚扎在核基质蛋白（即非组蛋白支架蛋白）柱体上，以绊环形式筑构成400 nm直径的超螺旋管单体，由两个相同的单体交叉成姐妹染色体对。交叉点称之为着丝点，单体端点称为端粒，这就是通常所描写的染色体结构。在细胞周期的不同阶段，染色体的浓集出现和松散消失的形态学变化形式，是与细胞执行功能如分裂、凋亡、死亡、激活、静止密切相关的。以上这两种变化之间在结构上如何体现出来，与什么因素有关，这是值得研究的问题，研究的方法有X线晶体衍射、多维核磁共振、电子显微镜观察等。本文所报道的DNP黏弹性研究以及试图应用Mexwell方程的拟合也是一个提供信息的补充方法。

1 材料与方法

1.1 猪肝DNP制备 新鲜猪肝0 ℃～4 ℃下完成以下操作，将20 g猪肝组织放入400 mL的NaCl-EDTA溶液（内含0.15 mol/L NaCl与0.01 mol/L EDTA，以下称为NaCl-EDTA）中，用组织捣碎机打成匀浆，再用玻璃匀浆管研磨后，用4层纱布过滤，滤液用700 g离心30 min，弃上清液，将沉淀用NaCl-EDTA清洗4 次。所得沉淀即为DNP，悬浮于NaCl-EDTA中，通过紫外光谱与化学分析属于DNP，纯度在95%以上[7]。

1.2 仪器 美国Brookfield公司的程序性DVⅡ流变仪，在Windows下应用该公司的软件，编制自动采样程序，作各种数据采集、贮存、回归、拟合、数据处理。

1.3 操作方法 取DNP溶液2 mL，置于流变仪测量杯中，切变率值由仪器与电脑软件控制下自动采集切应力、切变率、温度、时间等数据[8]。测量温度控制在(20±0.1)℃。DNP浓度控制：相当于8 mg干DNP/mL的浓度。NaCl-EDTA基础上（内含0.15 mol/L NaCl与0.01 mol/L EDTA）氯化钠浓度的控制：用适合的氯化钠重量加入达到所需的浓度。

2 结果

2.1 DNP的表观黏度、切变率、氯化钠浓度三者关系 结果如表1所示，可见DNP溶液表观黏度值随氯化钠浓度增加而增加，而随切变率的增加而下降。

表1 DNP溶液表观黏度（mPa•s）、施加切变率、溶液中氯化钠浓度三者关系

2.2 DNP溶液黏弹性实验数值与Maxwell方程的拟合 将图1中氯化钠浓度为3 mol/L的DNP样本，进行黏弹性的实验，其实验数据用Maxwell方程进行了拟合，发现当加载0.6 s－1切变率矩形波应力上升线方程：τ＝τ0(1－e-t/λ)（式中：τ为应力，单位mPa；τ0为矩形波切变率作用后的平衡应力，单位也是mPa；t为作用时间，单位为s；λ为滞后时间，单位也是s；e为自然对数的底，即2.71828……）与实验结果基本符合（结果如图2所示，图中τ0＝159 mPa，是在测定应力第130s时的读数。λ＝38 s，λ为方程的参数，其单位与时间s具有相同的量纲，系通过曲线回归求出的[9]。式中τ0、λ两个参数，从理论上决定了这方程上升曲线的走向）。

图1 Maxwell方程数值与实验数值之间的比较。图中横坐标为时间，前10 s为静止等待，箭头朝下处示给系统施加0.6 s-1的切变率120 s之始，箭头朝上示给该切变率的撤销后继续采样120 s。总采样时间为250 s，每秒采一数值样本。合计250 个数字。图中可见在矩形波加载线（即上升线）Maxwell方程数值与实验数值之间基本符合（χ2检验，P＞0.05），但是切变率矩形波撤销后的衰减Maxwell方程数值与实验数值之间是不符合的（χ2检验，P＜0.05）。

图2 实验数值与本文修正方程数值比较。可见在切变率矩形波撤销后衰减线实验值与修正方程值符合（χ2检验，P＞0.05）。

当该切变率矩形波撤销后的应力衰减实验数值与Maxwell的衰减线方程：τ＝τ0e-t/λ相比是明显不可拟合的（结果如图1所示）。

本文作如下修正：τ＝τ0e-t/λ＋∆τ(1－e-t/λ)（说明：∆τ为原Maxwell方程式与实验平衡状态数值在时间坐标250 s时的差值）。图2示实验结果与本文新改良方程符合（式中∆τ＝46 mPa，λ=10 s）。

2.3 不同氯化钠浓度（0、1.5、3 mol/L）的DNP溶液、在不同矩形波切变率（0.6、3、12、60 s-1）施加与撤销期间的应力-时间（τ-t）上升线与衰减线的实验曲线观察

2.3.1 方程参数滞后时间λ数值：结果如表2所示。滞后时间λ数值的有无或大小，是判别物体是否属于黏弹性体的标志之一。如果λ趋向于0 s，就不是黏弹性体，而是属于牛顿流体或触变性流体。如果λ有一定数值，就标志着是黏弹性体。从表2可见，DNP溶液具有较大数值的滞后时间λ的条件是，较高的氯化钠浓度与较低的切变率矩形波，如在3 mol/L与1.5 mol/L氯化钠浓度在0.6 s-1切变率矩形波条件下分别有38 s与36 s的滞后时间，而其他条件下则滞后时间数值较低或甚至为0 s。滞后时间λ是通过实验数值用方程曲线回归的方法得到的[4]。

表2 DNP溶液在不同矩形波切变率与氯化钠浓度下的滞后时间λ数值（s）

2.3.2 方程参数平衡应力τ0数值：结果如表3所示。一般情况下黏弹性溶液的应力随着切变率矩形波的施加的时间，应力由零逐步上升至一个平衡数值τ0。本文记录的上升曲线的时间是120 s，可称之为应力上升曲线。当切变率矩形波撤销以后，剪切应力下降，可称之为应力衰减曲线。按照Maxwell理论应该是系统的应力逐步地释放出来，在撤销后的120 s时，应该恢复至0 mPa。表3中的τ0数值（mPa）是Maxwell方程中的参数，是整个曲线的峰值高度（即矩形波施加120 s时的应力值）。从表3中数据展示，平衡应力τ0数值（mPa）随着切变率的增加而增加，随着氯化钠浓度的增加而增加。

表3 DNP溶液在不同矩形波切变率与氯化钠浓度下的平衡应力τ0数值（mPa）

2.3.3 同一DNP溶解于3 mol/L氯化钠溶液，在不同切变率矩形波（0.6、3、12、60 s-1）作用下有不同的应力-时间（τ-t）上升与衰减曲线形状：结果如图3所示。图3中A与B所接受的矩形波切变率是比较低的，它们是属于黏弹性体的曲线，其上升线可与Maxwell方程拟合，但是其衰减线不能够拟合，而可用本文新建方程拟合。至于图3中C与D是接受较高矩形波切变率的，它们是不符合Maxwell方程的，而接近牛顿流体或触变性流体。由此可见同样一种溶液，可以因其接受的矩形波切变率的不同，其流体表现的黏弹性行为可以不同。从这里可以看出，作为肝脏DNP也好，或其他生物物质也好，要研究其黏弹性的非牛顿流体行为，采用高切变率条件，会把其黏弹性或非牛顿性淹没掉，外观上仅表现出是牛顿流体或触变性流体。

图3 同一DNP溶解于3 mol/L氯化钠溶液样本，在不同切变率矩形波作用下具有不同的应力-时间（τ-t）上升与衰减曲线

2.3.4 同一切变率（0.6 s-1）矩形波对DNP溶于三个不同氯化钠浓度溶液（0、1.5、3 mol/L）的不同应力-时间（τ-t）上升线与衰减线的观察与比较：结果如图4所示。先看图4A，该溶液仅属于原NaCl-EDTA溶液（内含0.15 mol/L NaCl与0.01 mol/L EDTA），相当于生理盐水的氯化钠浓度，其中DNP仅是细胞核染色体中蛋白质与DNA互相紧密结合的颗粒，当施加切变率0.6 s-1矩形波时，其应力就冲顶，然后应力衰减至平衡值46 mPa，滞后时间λ接近0 s，上升线不能与Maxwell方程拟合，下降线不能与本位方程拟合，应属于触变性流体。再看图4B，该溶液仅属于原NaCl-EDTA溶液基础上，再增加氯化钠浓度1.5 mol/L，其中DNP在增加氯化钠浓度后，促进了DNP的吸水性，致使DNP体积膨胀化，当施加切变率0.6 s-1矩形波时，其应力缓缓上升，平衡值达115 mPa，滞后时间λ为36 s，上升线能与Maxwell方程拟合，下降线能与本文建议方程拟合，属于黏弹性流体。再看图4C，该溶液在原NaCl-EDTA溶液上，再增加氯化钠浓度3 mol/L，其中DNP在如此增加氯化钠后，更加促进DNP的吸水性，致使DNP更加膨胀化，更成为黏弹性流体，当施加切变率0.6 s-1矩形波时，其应力缓缓上升，应力平衡值高达159 mPa，滞后时间λ为38 s，上升线能与Maxwell方程拟合，下降线能与本位方程拟合，更明显属于黏弹性流体。从上可以看出凭曲线的形态就可看出黏弹性溶液特征。

图4 同一切变率（6 s-1）矩形波对于DNP溶解于三个不同氯化钠溶液样本（0、1.5、3 mol/L），对其应力-时间（τ-t）上升线与衰减线的观察与比较。

3 讨论

DNP溶液表观黏度值随氯化钠浓度增加而增加，其原因在于氯化钠的离子成分能够促进原DNP浓缩的紧密结构吸入离子与水分，并与DNP分子链上某些基团结合，致使DNP分子所占的体积在空间膨胀延伸，成为膨胀化具有黏弹性的流体。DNP溶液表观黏度值随施加切变率增加而下降，原因在于剪切作用致使DNP分子的纤维顺着剪切力排列方向排列，减少了流动的阻力，或通过剪切作用而把分子某些支链剪断，减少分子间的互相牵拉作用，成为剪切稀化的流体。正由于如上两个作用，致使本文设计高氯化钠浓度（如3 mol/L）的DNP溶液在本文用最低切变率矩形波（0.6 s-1）作用下，显示其明显黏弹性体行为，其应力上升线可以被Maxwell黏弹性方程拟合，并具有38 s的滞后时间λ参数值。

至于为什么当施加切变率矩形波撤销以后，其应力衰减线的数值，不能够与Maxwell黏弹性方程拟合，原因在于该方程是基于理想黏弹性物体的，而DNP溶液不是理想的、应力完全可逆的流体，在施加切变率矩形波的上升线过程中，DNP分子受到应力剪切的历史，有不可恢复的改变或损伤的“记忆”，因此不能按照原方程恢复至起始原点应力为0的状态。本文加入“不可逆应力损失项∆τ(1-e-t/λ)”就与实验结果符合。上述上升线与衰减线相比，应该说前者更接近物体的本身性质。如果抛弃上升线，而仅仅采用衰减法，采集科学数据是不明智的做法。

Maxwell方程的应力-时间（τ-t）曲线的形状与走向，从理论上是由应力平衡值τ0与滞后时间λ这两个参数决定着的。其中滞后时间λ决定了该曲线的陡度，而其中应力平衡值τ0决定了该曲线的峰值高度。

Maxwell方程中的参数“滞后时间λ”，是液体牛顿黏度（η）与固体胡克刚性系数（G）的比值（η/G），液体牛顿黏度（η）的量纲是mPa•s，固体胡克刚性系数（G）量纲是mPa，其比值η/G的量纲则是时间s。此参数λ是由实验数据利用方程回归出来的。从表2和图4可见，DNP溶液具有较大数值的滞后时间λ的条件有两个：较高的氯化钠浓度与较低的切变率矩形波，例如在高达3、1.5 mol/L的氯化钠浓度与低至0.6 s-1切变率矩形波条件下，溶液具有30 s以上的滞后时间，而其他条件下则滞后时间λ数值比较低或甚至接近于0 s。应该说滞后时间λ数值接近于0 s，其曲线是很陡的，就不是黏弹性流体，而是触变性流体或牛顿流体。因此滞后时间λ数值大小或有无，是判别是否属于黏弹性流体的标志。

平衡应力τ0数值是Maxwell方程中的参数之一，它确定了曲线的峰值高度，随矩形波切变率的增加而增加，随着氯化钠浓度的增加而增加，但它的大小不是黏弹性的决定因素（因为非弹性体也有），而仅是决定曲线平衡值高度而已，决定黏弹性的有无与程度应是滞后时间λ数值。

Maxwell方程曲线上升的陡度形状是由滞后时间λ数值决定的，观察曲线的形状可以判别溶液是否属于黏弹性流体。图3展示同一DNP溶解于3 mol/L氯化钠溶液的样本，在不同切变率矩形波作用下具有明显不同的应力-时间（τ-t）上升与衰减曲线。当该样本所接受的矩形波切变率是比较低（如0.6、3s-1）时，是属于黏弹性体的曲线的，其上升线可与Maxwell方程拟合，其衰减线可用本文新建方程拟合。当接受较高矩形波切变率（如12、60 s-1）时，它们是不符合Maxwell方程的，而接近牛顿流体或触变性流体。可见同一样本，可因其接受的矩形波切变率的不同，其流体表现的黏弹性行为可不同。

同一切变率（0.6 s-1）矩形波对DNP溶于三个不同氯化钠浓度溶液（0、1.5、3 mol/L）的不同应力-时间上升线与衰减线观察展示，当DNP溶于0 mol/L氯化钠溶液中，当施加该切变率矩形波时，其应力就冲顶，滞后时间λ接近0 s，上升线不能与Maxwell方程拟合，下降线不能与本文方程拟合，应属于触变性流体。当DNP溶于1.5 mol/L氯化钠浓度，当施加切变率0.6 s-1矩形波时，其应力缓缓上升，平衡值达115 mPa，滞后时间λ为32 s，上升线能与Maxwell方程拟合，下降线能与本文建议方程拟合，属于黏弹性流体。当DNP溶于3 mol/L氯化钠浓度，当施加切变率0.6 s-1矩形波时，其应力缓缓上升，应力平衡值高达159 mPa，滞后时间λ为38 s，上升线能与Maxwell方程拟合，下降线能与本文方程拟合，它是更明显地属于黏弹性流体。

从这里可看出，作为肝脏组织DNP也好，或其他生物物质也好，要研究其黏弹性的非牛顿流体行为，采用高达几百切变率的条件，就会把生物物质原具有的黏弹性或非牛顿性性质破坏掉或淹没掉。茅福成[10]通过调查提出，流变仪种类繁多，方法原理不一，仪器设置参数、软件性能等方面不规范导致同一血样在不同医院的检测结果不同。指出有的公司有软件新旧之分，虽然检测原理相同，因参数设置、软件特点不同，造成检测结果不一。因此提出对此种仪器应有生产规范和质量检查标准。同时对生物黏弹性行为的数值测量，工作者也需要有良好的流变学理论与技能基础，因为测定数值依赖于所处的化学、物理、力学的条件，如果条件不同，所获得的结果与结论也不同，这也是科技工作者应该注意的。

本文以上报道的理论与应用价值，如不同的生物样本（如正常肝与肝癌），或其他生物样本，在方程参数τ0、∆τ与λ的医学生物学价值应有待进一步揭示。