CSE诱导支气管上皮细胞分泌外泌体miR⁃186促进肺成纤维细胞增殖

徐冬川，何蝉伊，林 琦，丁毅鹏

（海南省人民医院、海南医学院附属海南医院1.急诊科，2.全科医学科，海南 海口570311）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo⁃nary disease，COPD）是一种慢性呼吸系统疾病，其主要特征是持续呼吸流量有限，肺功能不可逆［1］。有数据显示，2020年慢性阻塞性肺疾病已成为全球第四大死亡原因［2］。研究表明，有20%的吸烟者会发展成COPD患者，而终身吸烟者50%是COPD患者［3］。外 泌体（exosomes）是指囊泡结构中，含有RNA或者蛋白的具膜小泡，直径一般在40～100 nm［4］。外泌体通过其携带的信使RNA（mRNA），miRNA和蛋白质等作用于受体细胞，从而影响受体细胞的增殖与迁移［5，6］。大量研究证实，目前已发现多种外泌体的miRNA参与COPD的发生与发展［7，8］。本研究探讨香烟提取物（cigarette smoke ex⁃tract，CSE）对支气管上皮细胞16HBE外泌体miR⁃186表达量的影响，以及16HBE来源的外泌体miR⁃186对肺成纤维细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人支气管样上皮细胞16HBE和人胚成纤维细胞MRC⁃5购于中国科学院上海细胞库。胎牛血清（FBS），MEM和DMEM培养液购于美国Gibco公司。miR⁃186引 物、miR⁃186 mimic和 阴 性 载 体（NC）由上海吉玛制药技术有限公司合成。CCK⁃8试剂盒购于武汉华美公司。Bcl2L 11、GAPDH一抗和二抗购于Thermo公司。使用美国FEI透射电子显微镜进行外泌体拍照。双荧光素酶试剂盒购自Promega公司。

1.2 CSE的制备

20支市售黄金叶牌香烟完全燃烧产生的烟雾，充分混合溶于20 mL无血清DMEM培养基中，之后使用0.22μm滤膜过滤，得到含CSE的DMEM母液［9］。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与CSE处理 16HBE和MRC⁃5细胞分别使用含10%FBS的DMED和MEM培养基，置于含有5%CO2以及温度37℃的细胞培养箱培养。16HBE细胞使用终浓度为20%的CSE刺激16HBE细胞48 h，收集细胞上清，采用超离的方式分离细胞上清外泌体。将从16HBE细胞收集的外泌体按CES处理后外泌体与溶剂对照外泌体分为CES⁃exo组及CON⁃exo组，每组3个重复处理MRC⁃5细胞。

1.3.2 外泌体分离 将收集的16HBE细胞上清在4℃以21 000g离心15 min，然后将上清液转移至新试管中。加入1/4体积的ExoQuick Solution（美国System Biosciences），上下混合后于4℃孵育2 h。1 500g离心混合物30 min，弃去上清液。再次1 500g离心5 min再次弃去上清液。加入PBS重悬外泌体。

1.3.3 透射电子显微镜（TEM） 将外泌体与等体积的4%多聚甲醛混合，转移10μL样品到聚乙烯醇缩甲醛/碳涂层的镍格栅上，室温下将膜吸附20 min。用100μL的PBS快速洗涤后，50μL 1%的戊二醛固定5 min，蒸馏水洗涤7次。之后用4%乙酸铀酰溶液浸泡样本5 min，冰上加入4%乙酸铀酰2%甲基纤维素（1∶9）溶液的混合物中孵育10 min。用滤纸吸干并自然风干，使用透射电子显微镜（日本JEOL，#JEM⁃2100）进行观察并进行拍照［10］。

1.3.4 外泌体RNA提取与qPCR检测 CES⁃exo组与CON⁃exo组处理后，使用外泌体RNA纯化试剂盒（美国System Biosciences）从外泌体中提取总RNA。用Bioanalyzer 2100仪器（美国安捷伦）评估分离的RNA浓度及其完整性。miDETECT A TrackTM miRNA qRT⁃PCR试剂盒包含miR⁃186与U 6特异的正向引物和与poly（T）接头互补的序列作为反向引物（中国锐博）。细胞上清中总外泌体RNA进行聚腺苷酸化，使用poly（T）衔接子逆转录为cDNA。使 用RT⁃PCR试剂盒（TaKaRa）和CFX96 PCR系统（美国Bio⁃Rad）检测miR⁃186表达。以U 6基因为内参，采用2⁃ΔΔct法比较CSE处理组和正常对照组表达差异。

1.3.5 CCK⁃8检测MRC⁃5细胞增殖 CES⁃exo组与CON⁃exo组处理后，选择处于对数生长期的MRC⁃5细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板，置于37℃恒温培养箱中培养。在细胞培养的第1天开始，连续5 d分别向每孔加入10μL的CCK⁃8溶液，使用酶标仪检测450 nm处的光密度（OD）值，以OD450值代表细胞增殖水平。

1.3.6 双荧光素酶验证miR⁃186与Bcl2L 11靶向结合 将miR⁃186与Bcl2L 11结合部位的野生型（WT）与突变型（MUT）序列分别插入到萤火虫荧光素酶基因下游构建表达载体。将miR⁃186 mimics与pmirGLO⁃Bcl2L 11⁃WT和MUT重组质粒，以及对照组miRNA⁃NC与Bcl2L 11的WT和MUT重组质粒与Lipo⁃2000脂质体混合后转染HEK 293T细胞，转染48 h后，采用酶标仪（BIO⁃RAD公司）检测荧光素酶活性。

1.3.7 Western blot检测 使用细胞裂解液提取每组细胞总蛋白，蛋白质浓度由BCA试剂盒测定，加5×Loading buffer在100℃金属浴15 min变性。上样时，计算使每组蛋白上样量为20μg蛋白，进行SDS⁃PAGE后将蛋白转移到0.22µm的PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗（1∶1 000），4℃过夜，洗膜6次，每次5 min，加入山羊抗兔二抗（1∶5 000），温室1 h。洗膜3次后，每次5 min。添加化学发光以显示蛋白，置于凝胶成像系统中拍照蛋白条带，使用Image J分析蛋白条带灰度表达，以GAPDH为相对内部参考得到蛋白相对表达。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计分析，GraphPad Prism6软件用于实验数据绘图，所有实验独立重复3次。计量数据采用（±s）表示，两组之间采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 分离16HBE外泌体的特征

透射电镜检测16HBE细胞上清外泌体发现，16HBE细胞分泌的外泌体呈现出直径约100 nm的球形囊泡结构，符合外泌体特征，见图1。因此本研究分离外泌体方法可以用于后续实验。

图1 透射电镜鉴定16HBE细胞外泌体囊泡结构（加速电压：100 kV；放大倍率：15 000×）Fig 1 Identifiation of the vesicle structur e of 16HBE cells exosomes using transmission electron mi‑croscopy（Acceleration voltage：100 k V；Magni‑fication：15 000×）

2.2 CSE明显促进16HBE分泌外泌体miR⁃186

通过qRT⁃PCR检测CSE处理支气管上皮细胞与未处理对照细胞的上清外泌体miR⁃186的相对表达 丰 度，CSE⁃exo组 中miR⁃186相 对 表 达 水 平（3.103±0.405）明 显 高 于CON⁃exo组（1.050±0.011）（t=5.070，P<0.01）。见图2。

图2 两组16HBE细胞上清外泌体miR⁃186相对表达量Fig 2 Expression of exosome miR‑186 in supernatant of CSE‑treated 16HBE cells and control group

2.3 CSE诱导16HBE外泌体miR⁃186促进MRC⁃5增殖

为确定CSE处理16HBE来源的外泌体miR⁃186对COPD患者成纤维细胞的影响，笔者使用从CSE处理的16HBE细胞上清中分离的外泌体miR⁃186（CSE⁃exo）培养MRC⁃5细胞，使用CCK⁃8法检测MRC⁃5细胞的生长。结果显示，第5天CSE⁃exo组MRC⁃5细 胞 的OD450相 对 变 化（OD450/fold）倍 数（7.217±0.101）明 显 高 于CON⁃exo组（4.915±0.117）（t=14.90，P<0.001），见图3；表明CES⁃exo组外泌体促进MRC⁃5细胞增殖。

图3 两组OD450相对变化（OD450/fold）倍数Fig 3 Comparison of OD450/fold between the two groups

2.4 miR⁃186对Bcl2L 11的调控作用

通过Targetscan数据库预测miR⁃186与Bcl2L 11结合，结合位点见图4A，双荧光素酶实验结果表明，Bcl2L 11+miR⁃186组相对荧光活性（0.683±0.045）明 显 低 于BCL 2L 11+miRNA⁃NC组（1.057±0.061）（t=4.893，P<0.01），而Bcl2L 11+miRNA⁃NC组相对荧光活性（1.053±0.024）与BCL 2L 11⁃MUT+miRNA⁃NC组（1.007±0.055）比较，差异无统计学意义（t=0.771，P=0.483），见图4B。Western blot检测显示，miR⁃186 mimic组中Bcl2L 11蛋白相对表达（0.306 7±0.020 0）明显低于NC组（0.733±0.029）（t=12.04，P<0.01），见 图4C、D。以上结果表明Bcl2L 11是miR⁃186调控的靶基因，并通过预测的靶点结合。

图4 miR⁃186靶向下调Bcl2L 11基因表达Fig 4 miR‑186 doenregulated the expression of Bcl2L11

3 讨论

COPD是一种常见的气流受限、呈进行性发展为特征的慢性疾病，目前COPD居全球死亡原因的第4位［11］。WHO和世界银行的一项研究表明，2020年COPD会成为世界疾病经济负担的第5位［12］。中国的COPD发病率为4%～6%，40岁以上的人群发病率为8.2%，其中男性为10.37%，女性为4.75%，严重危害着人民群众的健康［13］。COPD的临床研究尚且不能溯本求源。日益恶化的环境污染和人口的老龄化，都导致COPD的发病率升高，病程越来越复杂［12，14］。因此，需要进一步从不同角度阐明COPD的发病机制。

外泌体（exosomes）是细胞释放的含有一些特殊蛋白如CD9、CD63、CD81、CD82、Alix、TSG101的囊泡结构，具有完整磷脂双分子层，粒径40～100 nm［15］。本研究中鉴定的外泌体特征符合以上特征。目前已发现外泌体内miRNA参与多种疾病的发生发展，如神经疾病［16］、肿瘤［17］、COPD［18］等，提示外泌体包含的miRNA可能在疾病的进展中起到重要的作用。支气管上皮细胞衍生的miR⁃210则通过靶向调控ATG7基因表达直接调节自噬过程影响COPD的进展［19］。另一个源于支气管上皮细胞的外泌体miR⁃21则在吸烟引起的COPD中异常表达，可能作为COPD诊断或治疗的靶点［20］。

大量研究证实，miR⁃186在多种疾病中表达异常［21］。miR⁃186通过与circ0008305结合促进肝癌生长［22］。miR⁃186⁃5p通过靶向FOXK 1在人骨肉瘤中发 挥 肿 瘤 抑 制 作 用［23］。此 外，mir⁃186通 过 调 控IGF⁃1影响神经细胞凋亡［24］。miR⁃186靶向HIF⁃1α基因参与调控COPD成纤维细胞的增殖与凋亡［25］。但对于支气管来源的外泌体miR⁃186对COPD成纤维细胞的影响尚不清楚。

本研究发现，CSE处理能够明显诱导支气管上皮细胞16HBE分泌外泌体miR⁃186。使用16HBE细胞上清中的外泌体miR⁃186培养肺成纤维细胞MRC⁃5，能明显提高MRC⁃5的增殖活力。本研究通过生物信息学预测Bcl2L 11是miR⁃186的靶基因，采用双荧光素酶实验证明了miR⁃186通过预测的结合位点结合Bcl2L 11。此外，miR⁃186 mimic明显抑制了Bcl2L 11的表达。本研究也具有一定的局限性：（1）未能从临床样本或动物模型进一步验证研究结论。（2）对miR⁃186靶向抑制Bcl2L 11后调控的下游通路还未能进一步证明。笔者将延续本研究在临床样本与动物模型中进一步验证香烟诱导支气管上皮细胞外泌体mir⁃181对肺成纤维细胞的影响，并进一步探讨该途径下游调控的通路进而促进COPD疾病的分子机制。

综上所述，本研究表明CSE诱导支气管上皮细胞16HBE分泌的外泌体mir⁃181，通过外泌体进入对肺成纤维细胞后，能够靶向抑制Bcl2L 11促进肺成纤维细胞增殖。这可能是CSE促进COPD肺成纤维细胞增殖的机制之一，可能作为COPD临床干预手段的理论依据。

所有作者贡献度说明：

徐冬川：进行实验，文章写作；何蝉伊：数据统计分析；林琦：部分实验检测；丁毅鹏：实验统筹安排。