在大鼠药物辨别和小鼠催促戒断模型上评价右美托咪定的依赖性潜能

李 亮，曹福羊，田 冶，陈 瑛

（1.解放军总医院第六医学中心麻醉科，北京 100048；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，北京 100850）

右美托咪啶（dexmedetomidine，DEX）是一种新型高选择性α2肾上腺素受体（α2-adrenergic receptor，α2-AR）激动剂，具有镇静、抗焦虑和镇痛作用［1］。在啮齿动物和人类中，DEX通过激活中枢蓝斑突触前和突触后α2-AR产生近似自然睡眠的镇静作用，对呼吸功能的抑制作用较小，其独特之处在于患者易于唤醒与合作［2-3］。目前有研究表明，DEX具有一定的神经保护作用，可减少细胞凋亡［4-7］。此外，DEX对心、肺和肾等具有一定保护作用［8-9］。因其独特的药理特点，DEX广泛应用于麻醉诱导和维持、ICU插管镇静、程序性镇静和术后镇痛。然而，作用于中枢神经系统的药物，特别是镇静镇痛药，自身可能存在滥用或成瘾的隐患，对药物的依赖性潜能进行有效评估是临床安全用药的基石。

此前研究表明，DEX在大鼠条件性位置偏爱模型上表现出精神依赖潜能［10］，但在大鼠药物辨别模型上的精神依赖评价和小鼠催促戒断模型上的躯体依赖评价尚未见报道。药物辨别模型是一种研究药物辨别刺激性质的行为药理学实验方法，目前已广泛应用于中枢神经系统药物的精神依赖评价中，该模型提供了一种研究药物急性药理作用对动物内在体验反应的方法［11］。催促戒断模型是一种评价药物躯体依赖潜能的经典方法，具有实验周期短、戒断症状发作快、持续时间短、操作简便、经济等优点［12］。阿片类药物具有不同程度的依赖性潜力［13］。因此，本研究采用阿片受体激动剂吗啡作为建模阳性药物，在上述2个经典依赖模型上进一步评价DEX的依赖潜力，为药物的临床安全应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

20只清洁级雄性SD大鼠，初始体重220～250 g，实验训练期间限食限水饲养，使大鼠体重控制在300～350 g，其余时间自由摄食及饮水。60只清洁级KM小鼠，雌雄各半，4～6周龄，体重16～33 g，正常喂养，自由摄食及饮水。2个种属动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养环境为SPF级动物房，12 h/12 h昼夜自然光照，通风良好，室温20～26℃，湿度40%～60%。本研究实验动物的使用（动物数量、实验设计及对动物的处理）均遵循本单位实验动物伦理委员会相关规定。

1.2 药品

DEX注射液（200 μg·mL-1，恒瑞制药有限公司，批号：190222BP）；吗啡盐酸注射液（10 mg·mL-1，东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：180906-1）；纳洛酮盐酸注射液（0.4 mg·mL-1，北京凯因科技股份有限公司，批号：05190301），生理盐水（normal saline，NS）河北天成药业股份有限公司。DEX、吗啡和纳洛酮均于临用前用NS稀释至所需浓度。

1.3 仪器

AES-DSA20大鼠操作行为实验系统（安来科学仪器有限公司）。整个实验装置由大鼠操作行为箱和计算机控制系统组成。大鼠操作行为箱中配有左右鼻触，鼻触灯、笼灯和食物槽，若大鼠鼻触反应正确，则笼灯灭，鼻触灯亮，此时大鼠可从食物槽中获得糖水。实验过程由计算机自动控制完成。

1.4 大鼠药物辨别实验［14-15］

1.4.1 食物训练期

训练开始时采用固定比率（fixed ratio，FR）1（即鼻触响应1次就能得到1次糖水强化），若大鼠在同一程序下连续2 d在30 min内获得100次糖水，则FR值增加1次，要求大鼠依次完成FR1～FR10的训练。左右鼻触均为有效鼻触。

1.4.2 辨别训练期

完成食物训练的大鼠进入药物（吗啡或NS）辨别训练期。采用重复交替训练法，首先给予2 d吗啡训练，随后2 d给予NS训练，之后依次循环，以4个实验期为1个训练周期，每个实验期30 min。每个实验期前25 min sc给予吗啡2.5 mg·kg-1或等容积的NS，训练时指定操作箱内右鼻触为吗啡鼻触，左鼻触为NS鼻触。设定给吗啡时吗啡鼻触为有效鼻触，给NS时NS鼻触为有效鼻触。训练开始时FR1，即有效鼻触响应1次就能得到1次糖水强化，鼻触响应时鼻触灯亮，以大鼠在1个训练周期内反应正确率≥80%为合格。若大鼠达到合格标准，则FR值增加1次，FR值依次递增至FR10，记录大鼠的反应正确率。若FR值增加后，大鼠未达到训练标准，可通过增加训练周期或降低FR值重新训练，直到合格为止。当FR值增至10，大鼠连续2个训练周期反应正确率≥80%时，进行吗啡辨别测试。测试期前25 min sc给予相同训练剂量的吗啡或等容积的NS。测试期间，两鼻触均为有效鼻触，大鼠在任一鼻触上完成固定比率FR10都能得到糖水。若大鼠鼻触反应正确率≥80%，则表明大鼠能够辨别吗啡及NS，否则，仍进行训练期。

1.4.3 替代期

（1）吗啡替代：当大鼠在FR10程序下能够稳定辨别吗啡及NS后，分别sc给予吗啡0.3125，0.625，1，1.25和2.5 mg·kg-1进行替代实验。大鼠给予吗啡一个剂量测试完成后，重新FR10训练，待恢复基线值后进行下一个剂量测试，在替代实验期，两鼻触均指定为有效鼻触，记录大鼠鼻触反应的正确率，并与训练剂量下的辨别效应进行比较。

（2）DEX替代：吗啡替代实验结束后，大鼠继续用吗啡和NS在FR10程序下进行辨别训练，直至恢复基线值（吗啡测试后大鼠鼻触正确率≥80%），分别ip给予NS和DEX 5，10，20 μg·kg-115 min后放入操作箱中进行替代实验。记录大鼠鼻触反应的正确率，并与吗啡的辨别效应进行比较。在替代实验期，两鼻触均指定为有效鼻触。

1.5 小鼠催促戒断实验［16-17］

实验设DEX 5，20和40 μg·kg-1组，同时设NS组和吗啡组。每组12只小鼠，雌、雄各半。吗啡组递增剂量给予吗啡，依次为30，40，50，60和70 mg·kg-1，每天sc给药3次，即每日剂量依次为90，120，150，180和 210 mg·kg-1，连续给药 5 d；DEX 3个组恒定剂量分别每日ip给予DEX 5，20和40 μg·kg-1，连续给药 5 d，每天 2次；对照组连续5 d ip给予NS，10 mL·kg-1，每天2次。于末次给药6 h内，ip给予纳洛酮8 mg·kg-1进行催促戒断，观察纳洛酮催促30 min内小鼠的戒断跳跃次数及纳洛酮给药前后1 h小鼠体重的变化。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠药物辨别实验

2.1.1 大鼠吗啡辨别模型的建立

大鼠经过12～27个训练周期均能够在FR10程序下辨别吗啡2.5 mg·kg-1和NS，即注射吗啡时选择吗啡鼻触反应正确率≥80%，注射NS选择NS鼻触反应正确率≥80%。在吗啡测试期，大鼠对吗啡的鼻触反应正确率为（98.8±2.6）%，在NS测试期，大鼠对吗啡的鼻触反应正确率为（0.4±0.7）%（图1）。

2.1.2 不同剂量吗啡对辨别刺激效应的影响

对已形成吗啡辨别的大鼠，分别以吗啡0.3125，0.625，1，1.25和2.5 mg·kg-1替代训练剂量的吗啡。结果显示，不同剂量吗啡替代组的吗啡鼻触反应正确率分别为（4.4±14.6）%，（15.7±33.6）%，（42.1±43.6）%，（63.2±36.5）%和（93.0±23.4）%（图1），吗啡产生的辨别刺激效应呈剂量依赖性增长，当吗啡剂量等于训练剂量2.5 mg·kg-1时，大鼠吗啡鼻触反应正确率≥80%。当注射NS时，吗啡应答反应近乎零。吗啡0.3125和0.625 mg·kg-1剂量组不能替代吗啡2.5 mg·kg-1的辨别效能，吗啡1和1.25 mg·kg-1剂量组能部分替代吗啡2.5 mg·kg-1的辨别效能；剂量对数-反应正确率回归曲线拟合吗啡辨别ED50对应的剂量为1.089 mg·kg-1。

Fig.1 Drug-appropriate responding percentage in rats trained to discriminate morphine（Mor）2.5 mg·kg-1 from normal saline（NS）.Rats were trained under a fixedratio（FR）10-response schedule to discriminate Mor（2.5 mg·kg-1）from NS.Under this schedule，10 consecutive responses on one of the two nosepokes were reinforced with food presentation after a pre-session sc injection of Mor 2.5 mg·kg-1，and 10 consecutive responses on the alternative nosepoke were reinforced after NS sc injection.When daily performances were stable，substitution patterns for a range of doses of Mor（0.3125，0.625，1，1.25 and 2.5 mg·kg-1）were assessed during test sessions in which 10 consecutive responses on either nosepoke were reinforced.±s，n=18.

2.1.3 不同剂量DEX替代吗啡效应的影响

图2结果显示，分别ip给予NS或DEX 5，10和20 μg·kg-1进行替代实验。溶剂和不同剂量DEX替代组的吗啡鼻触反应正确率分别为（1.0±1.6）%，（2.1±6.2）%，（1.2±1.4）%和（1.8±2.6）%，反应正确率均低于20%（图2），表明DEX不能替代吗啡2.5 mg·kg-1。

Fig.2 Drug-appropriate responding percentage in rats trained to discriminate Mor 2.5 mg·kg-1from NS across various doses of dexmedetomidine（DEX）and NS.See Fig.1 for the rat treatment.When daily performances were stable，substitution patterns for a range of doses of DEX（5，10 and 20 μg·kg-1）were assessed during test sessions in which 10 consecutive responses on either nosepoke were reinforced.25 min after Mor and NS were sc given，or 15 min after DEX was ip given，the rats were tested.±s，n=18.

2.2 小鼠催促戒断实验

2.2.1 DEX对纳络酮催促小鼠跳跃次数的影响

与NS组相比，吗啡组小鼠30 min内的戒断跳跃次数（25.9±22.3）次，显著高于溶剂对照组（0.1±0.3）次（P＜0.01），表明吗啡亚急性给药诱发小鼠形成了躯体依赖；每日ip给予DEX 5，20和40 μg·kg-1的小鼠在纳洛酮催促30 min内的戒断跳跃次数分别为0.1±0.3，0.0±0.0和（0.0±0.0）次与NS组相比无统计学差异（图3）。

Fig.3 Effect of DEX on number of jumps in precipated withdrawal test in mice.The mice were ip given DEX 5，10 and 20 μg·kg-1·d-1for 5 consecutived days or sc given Mor at the increasing doses of 90，120，150，180 and 210 mg·kg-1·d-1 or NS for 5 consecutived days.Mice were ip injected naloxone at the dose of 8 mg·kg-1within 6 h after the last administration.±s，n=12.＊＊P＜0.01，compared with NS group.

2.2.2 DEX对纳络酮催促小鼠体重变化的影响

与NS组相比，吗啡组小鼠给药前后1 h的体重变化（1.6±0.6）g显著高于NS组（0.7±0.6）g（P＜0.01），表明吗啡亚急性给药诱发小鼠形成了躯体依赖；每日ip给予DEX 5，20和40 μg·kg-1组小鼠纳洛酮给药前后1 h体重变化分别为0.7±0.5，0.8±0.4和（1.0±0.6）g，与溶剂对照组相比无统计学差异。

Fig.4 Effect of DEX on change of body mass in precipated withdrawal test in mice.See Fig.3 for the mouse treatment.Change of body weight（g）=body weight before naloxone precipation（g）-body weight at 1 h after naloxone precipation（g）.±s，n=12.＊＊P＜0.01，compared with NS group.

3 讨论

目前国内外评价药物依赖性潜能的动物模型通常包括2大类，即精神依赖实验和躯体依赖实验。评价药物是否具有依赖性应结合精神依赖和躯体依赖模型。精神依赖模型包括条件性位置偏爱实验、自身给药实验和药物辨别实验，躯体依赖模型包括自然戒断实验和催促戒断实验［18-19］。本研究选择大鼠药物辨别实验和小鼠催促戒断实验评价DEX的依赖性潜能，以阿片类镇痛药物之一吗啡作为阳性对照药。吗啡成瘾主要与脑内多巴胺递质系统密切相关，通过与γ-氨基丁酸能神经元上的μ受体结合，抑制其活性，解除它对多巴胺能神经元的抑制作用，导致多巴胺释放增多，产生奖赏效应［20］。药物辨别模型能够模拟人类药物滥用的行为，其原理基于依赖性药物使人产生如欣快、满足感等情绪主观性效应，具有主观性效应的药物可以控制动物的行为反应，使之产生辨别行为效应。本研究发现，大鼠可以建立吗啡辨别刺激效应，这些结果与先前的报道结果是一致的，吗啡辨别效应的剂量反应曲线也是类似［21］。在吗啡应答反应中，大鼠吗啡鼻触反应正确率呈剂量依赖性增长，并在吗啡剂量等于训练浓度时，大鼠吗啡鼻触反应正确率＞80%。在大鼠吗啡辨别行为形成后的整个实验过程中，其反应基线值保持稳定，提示吗啡的主观感受没有表现出耐受现象。表明本实验建立的大鼠吗啡辨别模型稳定可靠，可用于评价DEX的精神依赖潜能。药物辨别实验中，根据鼻触反应正确率将替代药物与训练药物的辨别刺激性质的相似程度划分为3类，即药理性质与训练药物极其相似（＞80%）、中度相似（20%～80%）和不同（＜20%）。本研究结果发现，DEX（5，10，20 μg·kg-1）对吗啡的辨别效应均不产生替代作用，提示在大鼠药物辨别模型上DEX不会泛化吗啡，不具有类似吗啡的辨别刺激效应。与文献报道［10］测试剂量（不抑制动物自发活动剂量，不会产生假阳性的结果）的DEX在大鼠条件性位置偏爱模型上表现出精神依赖潜能的结果不一致，原因推测为2个模型的特点不同，条件性位置偏爱模型是非操作式的实验方法，将药物的奖赏效应作为非条件性刺激与伴药箱（条件刺激）联系起来，反映药物的正性强化作用，而药物辨别模型是操作式的实验方法，主要考察不同药物之间的“主观”用药感受相似性，可进行剂量关系比较从而定量地说明药物精神依赖性潜力的强度。因此，精神依赖性是机体对药物内在感知的综合体现，如满足、欣快感，很难用一种适宜的动物模型来体现，需要采用多种模型来综合评价。

催促戒断是指动物短时间内对药物形成依赖后，用拮抗剂催促诱导戒断症状的发生，观察动物的戒断症状并进行体重的测定，通常可观察到的典型催促戒断症状有跳跃、扭体、湿狗样抖动、齿颤、理毛、抓脸、上睑下垂、前爪震颤、腹泻等植物神经系统症状以及体重下降、体温降低等。在这诸多催促戒断症状中，戒断性跳跃和体重下降被认为是反映戒断症状强度的最敏感、最可靠的指标［22-23］。在躯体依赖实验中，本研究建立了吗啡依赖小鼠催促戒断模型，发现DEX每日5，20和40 μg·kg-1连续给药5 d后给予阿片受体拮抗剂纳络酮催促后30 min内几乎无戒断跳跃行为的发生，且纳洛酮给药前后1 h的体重变化与溶剂对照组相比无统计学差异，提示DEX在小鼠催促戒断模型上无致躯体依赖潜能。

综上，DEX在大鼠药物辨别模型和小鼠催促戒断模型上未表现出依赖性潜能。