间接酶联免疫吸附法测定血液中抗西尼罗河病毒单克隆抗体MlL94浓度及其应用

相亚楠，王灵超，高 尤，罗龙龙，张文鹏，庄笑梅

（军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，北京 100850）

西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）属于黄病毒科黄病毒属的B群虫媒病毒，病毒成球形，直径约50 nm，为单层囊膜结构，囊膜上有一层薄层突起，呈棒状结构［1-3］。WNV全基因组由约11 kb核苷酸组成，属不分节段的单股正链RNA病毒［4］。WNV于1937年在西尼罗河地区一位发热的成年妇女血液中分离得到，因此命名为西尼罗河病毒［5］。西尼罗河热（West Nile fever，WNF）是由WNV引起的一种人畜共患病，主要经蚊传播，可导致人类神经系统疾病甚至死亡，也可引起马、禽类和猫等动物发病［6］。

WNV病在非洲、中东、西部及中部亚洲、大洋洲和欧洲部分地区广泛流行，自1999年起首次在北美洲大面积流行。最近，先后于1994年在阿尔及利亚、1996-1997年在罗马尼亚、1999-2002年在美国发生WNV病导致的脑炎病例［7-9］。目前我国尚无WNV病发病的报道。随着国际交流增多、商贸交易频繁以及鸟类迁徙，该病有传入我国的风险，因此必须高度警惕WNF在国内的传播。

目前尚无批准上市的疫苗及药物用于人感染WNV的预防和治疗。2003年，美国批准马用甲醛溶液灭活WNV疫苗上市，其保护效率可达94%，但必须每年加强注射［10］。与疫苗需要提前注射相比，抗体药物用于感染后治疗，受试人群缩小，节约了人力、物力和财力，因此开发抗WNV治疗性抗体迫在眉睫。迄今已有数个单抗药物进入非临床研究（如CR4348和CR4354）以及临床Ⅱ期试验（如hE16和pE16），但其最终能否被批准用于临床治疗仍面临许多挑战［11］。MIL94是由军事医学研究院研究的抗WNV全人源单抗，该抗体是由CHO细胞表达产生，具有免疫原性低、不受季节影响、生产力高等优势。前期小鼠染毒实验结果显示能全保护（数据未公开），正在进行系统非临床药动学研究。

本研究拟优化建立一种特异、灵敏的定量检测食蟹猴血清中MIL94浓度的间接ELISA，经全面验证后，进行食蟹猴体内药动学的初步研究。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

普通级食蟹猴12只，北京协尔鑫生物资源研究所有限责任公司提供，许可证号：SCXK（京）2015-0011；年龄3～4岁，体重2.5～3.5 kg，实验期间动物自由取食、饮水，食蟹猴接受的所有操作均符合本单位实验动物伦理委员会规定（IACUC-DWZX-2020-627）。

MIL94标准品（7.2 g·L-1，批号：190410，军事医学研究院）；食蟹猴空白血清（批号：20190928，北京协尔鑫生物资源研究所有限责任公司）；抗原：envelope protein（domain Ⅲ，His Tag）（货号：40345-V08Y，美国Sino Biological公司）；二抗：辣根过氧化物标记的羊抗人IgG（货号：SE101，北京Solarbio公司）；TMB显色液（货号：00-4201-56，美国invitrogen公司）；洗涤液PBST溶液（含0.05% Tween 20的PBS（自行配置）；pH 7.4 PBS（货号：C10010500BT，美国Gibco公司）；酪蛋白封闭液（货号：C5890，美国Sigma公司）；氮化钠注射液（批号：2006103205，石家庄四药有限公司）。

SPECTRO starNano型酶标仪（德国BMG LABTECH公司）；微量加样器（美国Eppendorf公司）；离心机和96孔板（美国Thermo公司）；微量振荡器（广州SCILOGEX公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；洗板机（北京天石天力医疗器械技术开发中心）；促凝采血管（美国BD公司，添加SST Amber高分子凝胶促凝）。

1.2 间接酶联免疫吸附实验（ELlSA）

①包被：用包被缓冲液将WNV抗原稀释到1 mg·L-1，于酶标板中每孔加100 μL包被，4℃包被过夜。②洗涤：用洗板机反复洗板5次，拍干。③封闭：每孔加200 μL酪蛋白封闭液，37℃孵育1 h。④洗涤：用洗板机反复洗板5次，拍干。⑤加样品：用空白食蟹猴血清稀释系列浓度（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32和64 mg·L-1）的MIL94制备成标准曲线样品，同法配制0.5，1.6和25 mg·L-1MIL94质控样品，每孔加100 μL，每个样品平行做2孔，37℃孵育2 h。⑥洗涤：用洗板机洗板5次，拍干。⑦酶标抗体：用二抗稀释液按1∶10 000稀释HRP标记的羊抗人IgG，每孔加100 μL，37℃避光孵育1 h。⑧ 洗涤：用洗板机反复洗板5次，拍干。⑨显色：每孔加100 μL TMB显色液，室温避光放置10 min。⑩ 终止：每孔加100 μL 2N H2SO4终止液终止反应。⑪测定：酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值（A450nm）。

数据处理：将标准曲线样品浓度值（X）与所测定的吸光值（Y）利用SPECTRO starNano软件的四参数法进行拟合，根据得到的四参数方程式计算待测样品的浓度。四参数拟合方程为：Y=Bottom+（Top-Bottom）/（1+（EC50/X）^Slope）。其中Top为拟合曲线的上端渐进线的估计值（A值），Bottom为拟合曲线的下端渐进线的估计值（A值），Slope为校正曲线的斜率，X为实测浓度，EC50为50%吸光度值对应的样品浓度，通过拟合最优的曲线作为校正曲线。

方法学验证：按生物样品临床前药动学指导原则要求，进行了特异性、精密度和准确度、稀释线性和钩状效应、平行性选择性和稳定性等全面验证。

1.3 药动学实验

给药方案：12只食蟹猴随机分为2组，每组6只，雌雄各半给药剂量为5和100 mg·kg-1。给药量按食蟹猴体重计算，推注前用注射用生理盐水将MIL94稀释至所需浓度，控制推注速度确保食蟹猴在30 min内推注完毕。

血清样品的制备：给药前采集食蟹猴空白血，并分别于给药开始后5 min、给药结束即刻、给药开始后1，2，4，8，24 h，3，5，7，10，14，21，28，35，42，49，56和63 d于头静脉采血，每次采血量约1 mL，置促凝离心管中。全部血样均于室温凝固30 min后，4℃，2500×g离心10 min获得血清，分装后于-40℃冻存，待测。

数据处理：用WinNonlin软件，按非房室统计矩模型计算静脉推注给药后食蟹猴的主要药动学参数：曲线下面积（area under curve，AUC），清除率（clearance，Cl），稳态表观分布容积（steady state apparent distribution volume，Vss），消除半衰期（half life，t1/2）和平均驻留时间（mean residence time，MRT）。采用 Microsoft EXCEL（2010）计算均值，使用GraphPad Prism 6作图。

2 结果

2.1 食蟹猴血清中MlL94 ELlSA方法学验证

2.1.1 标准曲线

测定浓度为0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32和64 mg·L-1的10个标准曲线样品，0.125和64 mg·L-1作为锚定点，每个浓度设2个复孔。结果表明，MIL94在0.25～32 mg·L-1范围内，浓度的对数值与A值呈S形曲线（图1）。

Fig.1 Standard curve of MlL94 in cynomolgus monkey serum sample obtained by four parameters fitting method.The logarithmic concentration value of the standard curve is an S-shaped curve with the response value.The standard curve ranges in concentration 0.125-64 mg·L-1.The fourparameter fitting equation is：Y=Bottom+（Top-Bottom）/（1+（EC50/X）^Slope），r2＞0.99.Top is the estimated value（A450 nmvalue）of the asymptotic line at the upper end of the fitting curve.Bottom is the estimated value（A450 nmvalue）of the asymptotic line at the lower end of the fitting curve.Slope is the slope of the correction curve.X is the measured concentration.EC50is the sample concentration corresponding to 50% light absorption value，and the optimal fitting curve is used as the correction curve.

2.1.2 特异性

采用该ELISA考察人IgG与WNV抗原包被板的反应性。结果显示，人IgG与MIL94不存在交叉反应，食蟹猴血清基本无反应本底（表1）。

Tab.1 Concentration of MlL94 measured after adding different doses of human-lgG

2.1.3 精密度和准确度

按制备标准曲线的方法制成MIL94 0.5，1.6和25 mg·L-1的质控样品，通过建立的方法进行测定，计算板间与板内的精密度，由同一板上的标准曲线回归方程计算出各浓度MIL94的检出量。准确度范围分别为板内105.4%～108.1%，板间98.0%～106.9%；精密度分别为板内1.18%～4.62%，板间8.19%～10.2%。均符合生物样品分析方法验证M10中的要求（表2）。

Tab.2 Precision and accuracy of MlL94 in cynomolgus monkey serum of ELlSA

2.1.4 稀释线性和钩状效应（HOOK效应）

由于MIL94在食蟹猴体内药动学实验中给药剂量较大，实际血清样品浓度较高，超出了标曲定量范围，需要进行稀释，因此对血清样品的稀释准确度进行考察。而抗体浓度过高时可能出现抗原抗体比例不合适而导致假阴性现象，因此需要考察钩状效应［12］。用食蟹猴混合空白血清分别稀释3个MIL94高浓度样本（1000，2000和4000 mg·L-1）作为钩状效应样本，然后分别稀释1000，2000和4000倍至1 mg·L-1作为稀释线性样本进行验证。钩状效应样本最高浓度选择4000 mg·L-1是因为此浓度与MIL94食蟹猴高剂量给药时体内血药浓度一致。实验结果表明，稀释线性满足要求，钩状效应样本的A值与标曲高点响应一致，该剂量下无明显的钩状效应（表3）。

Tab.3 Linear dilution of MlL94 in cynomolgus monkey serum of ELlSA

2.1.5 平行性

平行性考察不同的稀释倍数是否对测量结果的准确性产生影响。选取3个真实样本，用空白食蟹猴混合血清将3个样本分别稀释不同倍数（1000，2000和5000倍）至标准曲线范围内。结果表明，3个样本的RSD（%）介于7.4%～16.9%，在最高稀释倍数（5000倍）下，不会对样品的准确度造成影响。

2.1.6 选择性

准备10个单只食蟹猴空白血清样本，每个血清样本制备1个空白样本，1个定量下限样本（low limit of detection，LLOQ），1个高浓度质控样本（high concentration quality control，HQC）。结果表明，10个空白食蟹猴血清样本回算浓度均低于LLOQ，MIL94的LLOQ与HQC的血清样本检测的准确度分别介于96.8%～118.8和99.13%～116.59%之间，满足生物样品验证指导原则M10的要求。

2.1.7 稳定性

低浓度质控（low concentration quality control，LQC），HQC的样本配制即刻（C0），常温放置4 h，-40℃放置7，14和28 d及反复冻融3次和5次后（每个浓度水平3个样本）测定，样品冻存至28 d稳定，可用于食蟹猴静脉推注MIL94后药动学评价（表4和表5）。

Tab.4 Short-term stability of MlL94 in cynomolgus monkey serum samples

Tab.5 Long-term stability of MlL94 in cynomolgus monkey serum samples

2.2 单次静注不同剂量MlL94后食蟹猴体内药动学特征

单次静注不同剂量后MIL94在食蟹猴体内的血药浓度-时间曲线见图2。用WinNonlin软件，按非房室统计矩模型计算静脉给药后食蟹猴的主要药动学参数（表6）。结果提示，MIL94食蟹猴静推给药后，两剂量组间t1/2、Vss、MRT较为接近，体内暴露量AUC与给药剂量基本成线性，Vss与食蟹猴血清容量一致，说明MIL94主要分布在血液中MRT较长，在10 d以上。

Fig.2 Mean serum concentration-time curves of MlL94 in cynomolgus monkeys after two doses of MlL94（5 and 100 mg·kg-1）were intravenously injected.Four cynomolgus monkeys were randomly divided into 2 groups with 2 monkeys in each and the drug doses were 5 and 100 mg·kg-1.The dosage was calculated according to the body mass of the cynomolgus monkeys.The route of administration was intravenous injection（IV）.MIL94 was diluted to the required concentration with 0.9% normal saline before infusion，and the infusion speed was controlled to ensure that the cynomolgus monkeys were injected within 30 minutes.The X axis represents the time of blood collection，and the Y axis represents the serum drug concentration.x±s，n=6.

Tab.6 Main pharmacokinetic parameters of MlL94 in cynomolgus monkeys after two doses of MlL94（5 and 100 mg·kg-1）were intravenously injected

3 讨论

本研究建立的间接ELISA检测方法的定量下限0.25 mg·L-1，线性范围达＞125倍。方法开发时有3个关键点：①洗涤缓冲液筛选了PBS和含不同比例Tween 20的PBS，结果表明洗涤缓冲液（PBST）中添加0.05%表面活性剂Tween 20时洗脱能力最好；②单一成分的封闭液无法达到完全封闭的效果，尝试了BSA、酪蛋白、脱脂奶粉等蛋白进行优化，最终选择10%脱脂奶粉作为封闭液，稀释液体积比为PBS∶PBST∶酪蛋白=2∶1∶1；③ 方法建立后先考察特异性，确证本法能排除相关基质干扰，再进行精密度、准确度等考察。通过对以上关键点的优化，结果表明，建立的食蟹猴血清中MIL94的间接ELISA检测方法在特异性、准确度、精密度、稀释线性和稳定性等方面均符合生物样品分析指导原则M10［13］的要求，可用于食蟹猴血清MIL94的定量检测。

单抗药物在体内的分布和清除过程与新生儿Fc受 体（Neonatal Fc receptor，FcRn）密 切 相关［14-16］，而FcRn与单抗的结合具有种属特异性。由于MIL94是全人源化单抗，通过与人体hFcRn特异结合而介导其组织分布和转运。在非临床研究阶段，由于物种差异，动物体内的药动学特征很难外推到临床。从动物种属来说，非人灵长类实验动物与人类的遗传物质有75%～98.5%同源性［17-18］，是最接近人的物种。因此，采用食蟹猴进行临床前药动学研究意义极大。

食蟹猴静注MIL94 5和100 mg·kg-1后，体内药动学特征显示，在5～100 mg·kg-1给药剂量范围内，AUC与给药剂量基本成比例；Cl很低，且不随给药剂量改变；末端t1/2＞10 d。Vss也不随给药剂量改变，且与食蟹猴血容量相当（45 mL·kg-1）［19-20］，提示MIL94作为大分子类单抗药物，难以透过细胞膜进入组织，主要在循环血液中分布，其分布和排泄特征正在大鼠体内进行研究。

综上，本研究建立的间接ELISA测定食蟹猴血清中MIL94浓度的方法满足非临床药动学研究需求，并初步获得了MIL94在食蟹猴中线性暴露和消除的药动学特征，为MIL94的非临床及临床药动学系统研究提供了支持。