UPLC同时测定通迪胶囊中8个活性成分的含量△

薛尧，展冠军，马静

南京市大厂医院，江苏 南京 210048

通迪胶囊由三七、紫金莲、延胡索、七叶莲、鸡矢藤、细辛6味中药制成，具有活血行气、散瘀止痛之功效，临床常用于头痛、痛经、肩颈痹痛、脘疼痛、胃痛、跌打疼痛、术后疼痛及癌症疼痛等[1]。方中君药三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根茎，具有散瘀止血、消肿定痛之功效，主要含有皂苷类成分和多糖化合物，其中活性成分主要为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1[2-3]；紫金莲所含主要活性成分白花丹醌，其显著的抗菌、抗病毒、抗凝血、抗生育、降血压及祛痰等作用，对痤疮和细菌感染引起的疖也有很好的治愈作用[4-5]；延胡索具有活血散瘀、理气止痛之功效，其活性成分主要为生物碱类，典型代表化合物有去氢延胡索甲素、延胡索乙素等，是延胡索发挥镇痛、镇静解痉主要药理活性成分[6-7]；鸡矢藤是一种常用民族民间药，具有消食健胃、化痰止咳、清热解毒及止痛的功效，环烯醚萜苷类成分鸡矢藤苷甲酯是其主要生物活性成分，是其抗炎镇痛作用的主要药理活性成分[8-10]。通迪胶囊现行标准中对三七中人参皂苷Rb1等成分做了定量检测规定，相关文献也有采用高效液相色谱法(HPLC)检测通迪胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、细辛脂素、白花丹醌等成分，但未见采用超高效液相色谱法(UPLC)测定通迪胶囊中多种活性成分的报道[11-14]。

本研究采用UPLC同时测定通迪胶囊中三七皂苷R1、白花丹醌、去氢延胡索甲素、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、延胡索乙素、鸡矢藤苷甲酯和人参皂苷 Rb18个活性成分含量，方法简单实用、科学准确，能为系统客观评价通迪胶囊质量提供参考。

1 材料

ACQUITY UPLC M-Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；AE 224 型触摸式彩屏电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；HU 6150D型恒奥数控超声波清洗器 (天津市恒奥科技发展有限公司)；LabTower EDI型超纯水仪(美国赛默飞世尔公司)。

通迪胶囊市售，规格：0.45 g/粒，贵州景诚制药有限公司生产，批号分别为180301、180510、180601、180605、180903、181012、181015、190305、190401、190402；去氢延胡索甲素对照品(批号：131220，纯度：98.0%)购自上海融禾医药科技有限公司；鸡矢藤苷甲酯对照品(批号：27530-67-2，纯度：98.0%)购自上海源叶生物科技有限公司；白花丹醌对照品(批号：P0640，纯度：95.0%)购自上海纯优生物科技有限公司；白花丹醌对照品(批号：SLBG3436V，纯度：98.0%)购自美国Sigma公司；对照品三七皂苷R1(批号：110745-201619，纯度：5.0%)、人参皂苷Re(批号：110754-201827，纯度：93.4%)、人参皂苷Rg1(批号：110703-201731，纯度：93.6%)、人参皂苷Rb1(批号：110704-201726，纯度：91.1%)、延胡索乙素(批号：110726-201718，纯度：99.6%)均来源于中国食品药品检定研究院；甲醇和乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相为乙腈(A)-0.03%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～5 min，2%～10%A；5～8 min，10%～13%A；8～15 min，13%～16%A；15～20 min，16%～45%A；20～26 min，45%～50%A；26～33 min，50%～65%A；33～35 min，65%～2%A)；检测波长：203 nm(0～6、13～18、26～35 min，检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1)、270 nm(6～13 min，检测白花丹醌及去氢延胡索甲素)、280 nm(18～20 min，检测延胡索乙素)、347 nm(20～26 min，检测鸡矢藤苷甲酯)；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL；柱温：30 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 精密称取三七皂苷R1、白花丹醌、去氢延胡索甲素、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、延胡索乙素、鸡矢藤苷甲酯和人参皂苷 Rb1对照品各适量，加85%甲醇制成三七皂苷R11.531 mg·mL-1、白花丹醌0.552 mg·mL-1、去氢延胡索甲素0.802 mg·mL-1、人参皂苷Rg11.006 mg·mL-1、人参皂苷Re 0.525 mg·mL-1、延胡索乙素1.036 mg·mL-1、鸡矢藤苷甲酯0.248 mg·mL-1和人参皂苷Rb10.569 mg·mL-1的混合对照品储备溶液。精密量取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，加85%甲醇稀释至刻度，混匀，滤过(0.22 μm)，取续滤液，即得混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取通迪胶囊内容物适量，混合均匀，取细粉约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入85%甲醇35 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷置室温，再称定质量，用85%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过(0.22 μm)，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

取混合对照品溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱条件，精密吸取2 μL注入UPLC仪，记录色谱图，结果见图1。结果，各目标化合物与前后杂质峰分离完全(>1.5)，色谱峰对称性良好(0.92～1.16)，理论塔板数均大于5500，表明该色谱系统适应本方法。

注：A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；1.三七皂苷R1；2.白花丹醌；3.去氢延胡索甲素；4.人参皂苷Rg1；5.人参皂苷Re；6.延胡索乙素；7.鸡矢藤苷甲酯；8.人参皂苷Rb1。图1 对照品及通迪胶囊UPLC图

2.4 线性关系考察

取2.2.1项下混合对照品储备溶液，精密吸取0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，加85%甲醇稀释至刻度，摇匀，得不同质量浓度对照品混合溶液。按2.1项下色谱条件分别进行测定，记录色谱图，以质量浓度(X)为横坐标，各成分峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，求算回归方程及r，结果见表1。取2.2.1项下混合对照品溶液，按成倍稀释法，记录当信噪比(S/N)=3及S/N=10时各成分质量浓度，分别标记为该成分检测限和定量限，结果见表1。

表1 通迪胶囊线性关系、检测限及定量限考察结果

2.5 精密度试验

取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6针，记录色谱图峰。结果三七皂苷R1、白花丹醌、去氢延胡索甲素、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、延胡索乙素、鸡矢藤苷甲酯和人参皂苷 Rb1峰面积的RSD分别0.3%、0.5%、0.4%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.3% (n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一批通迪胶囊供试品(批号：180301)溶液，按2.1项下色谱条件，分别于配制后0、3、6、9、12、24、36、48 h进样，结果三七皂苷R1、白花丹醌、去氢延胡索甲素、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、延胡索乙素、鸡矢藤苷甲酯、人参皂苷 Rb1峰面积的RSD分别为0.5%、0.8%、0.7%、0.4%、0.8%、1.1%、1.0%、0.6% (n=8)，表明48 h内供试品溶液的稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批通迪胶囊供试品(批号：180301)内容物适量，混合均匀，按2.2.2项下方法，平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定分析，记录色谱图峰面积，计算各成分含量RSD。结果三七皂苷R1、白花丹醌、去氢延胡索甲素、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、延胡索乙素、鸡矢藤苷甲酯、人参皂苷 Rb1含量RSD分别为0.4%、0.6%、0.4%、0.4%、0.7%、1.0%、0.8%、0.5%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的通迪胶囊样品(批号：180301)内容物适量，平行6份，每份1.0 g，精密称定，分别加入混合对照品储备溶液1.7 mL，按2.2.2项下方法制备，按2.1项下色谱条件进行测定分析，记录色谱峰，计算各成分的加样回收率及RSD，结果见表2。

表2 通迪胶囊8个成分的加样回收率试验结果

2.9 样品测定

取12批通迪胶囊样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，按外标法求算三七皂苷R1、白花丹醌、去氢延胡索甲素、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、延胡索乙素、鸡矢藤苷甲酯、人参皂苷 Rb1的质量分数，结果见表3。

表3 通迪胶囊中8个成分含量的结果(n=3) mg·g-1

3 讨论

3.1 提取条件的优化

本研究分别考察了不同提取介质(80%乙醇、30%乙醇、30%甲醇、85%甲醇及甲醇)、不同提取方式(浸渍、超声、加热回流)、不同提取时间(30、60、120 min)对通迪胶囊中8个成分提取效果的影响，结果显示，以85%甲醇为溶出介质时，加热回流2 h提取效果最佳。

3.2 色谱条件的优化

在波长选取时，笔者通过查阅相关文献资料，在200～400 nm波长对各考察成分进行光谱扫描，发现各成分最大吸收峰位置存在差异，以单一波长很难实现8成分同时测定，最终实验采用分段波长自动切换法开展，即203 nm(0～6、13～18、30～35 min，检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb1)、270 nm(6～13 min，检测白花丹醌及去氢延胡索甲素)、280 nm(18～20 min，检测延胡索乙素)，347 nm(20～26 min，检测鸡矢藤苷甲酯)[14-16]。流动相选取时，分别考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液及乙腈-0.1%醋冰酸水溶液等流动相系统，发现乙腈-0.1%磷酸水溶液系统最佳，在此条件下8个成分均有较好信号强度，且与前后杂质峰分离度较好，为减少高浓度磷酸溶液损伤仪器，最终流动相定为乙腈-0.03%磷酸水溶液进行梯度洗脱。

本研究建立UPLC同时测定通迪胶囊中8个活性成分含量，通过对准确性及精密度等指标的考察，发现方法准确度高、重复性好、简单实用，可用于通迪胶囊中三七皂苷R1、白花丹醌、去氢延胡索甲素、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、延胡索乙素、鸡矢藤苷甲酯、人参皂苷 Rb1含量的同时测定，为通迪胶囊质量评价提供参考。