基于UPLC的疏风解毒胶囊指纹图谱及多成分含量测定

金蕾，张贵萍，王温才

1.青岛市市立医院 药剂科中心药房，山东 青岛 266000；2.青岛市市立医院 药物临床试验研究科，山东 青岛 266000

疏风解毒胶囊由虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根、甘草8味中药制成，具有疏风清热、解毒利咽的功效，用于急性上呼吸道感染属风热证，症见发热、恶风、咽痛、头痛、鼻塞、流浊涕、咳嗽等[1]1784。现代药理学研究表明，疏风解毒胶囊对细菌、病毒、真菌等具有广泛的抑制作用[2]，临床广泛用于治疗社区获得性肺炎、手足口病、带状疱疹、慢性支气管炎、上呼吸道感染、流感等各类疾病，且治疗效果较为明显[3]。方中虎杖利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰，《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版含量测定指标成分为大黄素和虎杖苷[1]217；连翘清热解毒、消肿散结、疏散风热[4]，《中国药典》2020年版含量测定指标成分为连翘苷和连翘酯苷A[1]177；板蓝根性寒，清热解毒、凉血利咽[5]，《中国药典》2020年版含量测定指标成分为(R，S)-告依春[1]214；柴胡疏散退热、疏肝解郁、升举阳气，《中国药典》2020年版含量测定指标成分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d[1]293；马鞭草活血散瘀、解毒、利水、退黄、截疟，《中国药典》2020年版含量测定指标成分为熊果酸、齐墩果酸[1]53。疏风解毒胶囊现收载于《中国药典》2020年版，标准以连翘中连翘苷和虎杖中虎杖苷为质量控制指标成分[1]1784，目前，仅有对其单个或多成分含量测定的文献报道[6-8]，未见其指纹图谱的文献报道。为了能全面反映疏风解毒胶囊的质量特性，本研究建立疏风解毒胶囊超高效液相色谱法(UPLC)指纹图谱，并同时测定 9个指标成分的含量。

1 材料

1290型超高效液相色谱仪、二极管阵列检测器(安捷伦科技有限公司)；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；XS205DU型电子天平(d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司)；FRQ-1006HTD型超声波清洗机(杭州法兰特超声波科技有限公司)；Option-Q型纯水机(ELGA公司)。

疏风解毒胶囊均为同一生产厂家(市售)，12批样品批号分别为1852144、1912411、1906521、1903624、1812142、2002141、2003512、1906321、0911225、2001423、2003214、2004711，编号分别为S1～S12，规格为0.52 g/粒。对照品(R，S)-告依春(批号：111753-201706，纯度：100.0%)、连翘苷(批号：110821-201816，纯度：95.1%)、连翘酯苷A(批号：11810-201707，纯度：97.2%)、柴胡皂苷a(批号：110777-201711，纯度：91.1%)、柴胡皂苷d(批号：110778-201711，纯度：93.2%)、虎杖苷(批号：111575-201603，纯度：87.3%)、大黄素(批号：110756-201913，纯度：96.0%)、熊果酸(批号：110742-201823，纯度：99.9%)、齐墩果酸(批号：110709-201808，纯度：91.1%)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈(德国Merck公司，色谱纯)；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～5 min，10%A；5～15 min，10%～25%A；15～22 min，25%～30%A；22～33 min，30%～50%A；33～35 min，50%～10%A)；流速：0.3 mL·min-1；检测波长：0～8 min，220 nm[(R，S)-告依春]、8～13 min，310 nm(虎杖苷、连翘酯苷A)、13～35 min，220 nm(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、连翘苷、大黄素、齐墩果酸、熊果酸)；柱温：30.0 ℃；进样量：1.00 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 分别取(R，S)-告依春、虎杖苷、连翘酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、齐墩果酸、熊果酸、连翘苷、大黄素对照品各适量，精密称定后加甲醇适量，超声使溶解(功率：300 W，频率：40 kHz)，配制成含(R，S)-告依春146.9 μg·mL-1、虎杖苷2 285.0 μg·mL-1、连翘酯苷A 684.0 μg·mL-1、柴胡皂苷a 667.0 μg·mL-1、柴胡皂苷d 660.3 μg·mL-1、连翘苷429.7 μg·mL-1、大黄素1 066.0 μg·mL-1、齐墩果酸298.1 μg·mL-1、熊果酸415.0 μg·mL-1的混合对照品储备液，精密量取对照品储备液适量，置25 mL棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即为混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取本品10粒内容物混匀，研细，精密称定2.0 g，置于具塞烧瓶中，加入75%甲醇50 mL，精密称定后加热回流 1 h，取出，放冷，用75%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，即得。

2.3 高效液相色谱法(HPLC)指纹图谱的建立及方法学验证

2.3.1精密度试验 取样品(S1)的供试品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样5次，记录色谱峰，10号峰为参照峰(柴胡皂苷a)，以各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD为考察指标，结果均小于2.0%。

2.3.2稳定性试验 取供试品溶液(S1)，按2.1项下色谱条件，分别在 0、4、8、12、24、36 h进样，记录色谱图，以10号峰为参照峰(柴胡皂苷a)，以各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD为考察指标，结果均小于2.0%。

2.3.3重复性试验 取样品(S1)6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图中各待测组分的峰面积和保留时间，以10号峰为参照峰(柴胡皂苷a)，以各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD为考察指标，结果均小于2.0%。

2.3.4指纹图谱的建立及相似度分析 取样品(S1～S10)，依照2.2.2项下方法分别制备12批供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样，记录色谱数据，将12批样品的色谱数据的DCF文件导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)，对12批样品的 UPLC 图谱进行分析，生成疏风解毒胶囊指纹图谱，见图1(A、B)。12批样品与对照图谱的相似度分别为0.987、0.979、0.965、0.959、0.976、0.981、0.990、0.953、0.978、0.989、0.964、0.971，其相似度均大于0.95，疏风解毒胶囊同一厂家各批次间相似度良好，质量相对一致。

注：A.指纹图谱；B.对照指纹图谱；C.混合对照品色谱图；D.样品色谱图；4.(R，S)-告依春；5.虎杖苷；7.连翘酯苷A；10.柴胡皂苷a；13.柴胡皂苷d；17.连翘苷；19.大黄素；21.齐墩果酸；22.熊果酸。图1 12批疏风解毒胶囊UPLC图

2.3.5共有峰指认 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)”对12批样品的UPLC图谱进行分析，12批样品共有22个共有峰，在22个共有峰中，通过与各对照品峰的紫外吸收光谱图和保留时间比对，指认出4号峰为(R，S)-告依春、5号峰为虎杖苷、7号峰为连翘酯苷A、10号峰为柴胡皂苷a、13号峰为柴胡皂苷d、17号峰为连翘苷、19号峰为大黄素、21号峰为齐墩果酸、22号峰为熊果酸。

2.4 多指标成分的含量测定

2.4.1系统适用性试验 按2.1项下色谱条件，分别精密吸取2.2项下溶液各1.00 μL进样，结果各待测成分色谱峰与其相邻色谱峰分离度均符合要求(>1.5)，对称因子为0.97～1.32，理论塔板数以(R，S)-告依春、虎杖苷、连翘酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、连翘苷、大黄素、齐墩果酸、熊果酸峰计均在8900以上。色谱图见图1(C、D)。

2.4.2线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下混合对照品储备液适量，制备系列质量浓度的混合对照品溶液，按2.2项下色谱条件，精密吸取上述系列混合对照品溶液各1.00 μL进样，记录色谱图。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表1。

表1 疏风解毒胶囊各成分线性关系考察结果

2.4.3精密度试验 精密吸取2.2.1项下溶液1.00 μL，按2.1色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果表明，(R，S)-告依春、虎杖苷、连翘酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、连翘苷、大黄素、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别0.68%、0.93%、0.58%、1.0%、0.69%、0.32%、0.61%、0.78%、0.93%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.4稳定性试验 取样品(S1)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、24、36 h按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。(R，S)-告依春、虎杖苷、连翘酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、连翘苷、大黄素、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为1.2%、0.96%、1.0%、0.86%、1.1%、1.3%、0.92%、0.87%、0.95%(n=6)，表明在36 h内供试品溶液稳定性较好。

2.4.5重复性试验 取样品(S1)6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样，记录色谱图中各待测组分的峰面积，计算得(R，S)-告依春、虎杖苷、连翘酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、连翘苷、大黄素、齐墩果酸、熊果酸的平均质量分数分别为0.442、6.891、2.023、2.114、1.970、1.310、3.258、1.604、1.987 mg·g-1，RSD分别0.95%、0.49%、0.87%、1.00%、1.10%、0.69%、0.93%、1.30%、0.97%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.4.6加样回收率试验 精密称定已知含量的疏风解毒胶囊(S1)细粉6份，每份约1.0 g，分别精密加入混合对照品储备液3.0 mL，按2.2.2项下方法制备，按2.1项下色谱条件分析，记录色谱图中各待测组分的峰面积，计算各成分平均回收率及其RSD。结果见表2。

表2 疏风解毒胶囊9个成分的加样回收率试验结果

续表2

2.4.7样品测定 取疏风解毒胶囊12批，按照2.2.2项下方法，平行制备3份，按2.1项下色谱条件测定，记录(R，S)-告依春、虎杖苷、连翘酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、连翘苷、大黄素、齐墩果酸、熊果酸的峰面积，计算上述9个成分含量。结果见表3。

表3 疏风解毒胶囊中9个成分含量测定结果(n=3) mg·g-1

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本试验对不同厂家色谱柱、流动相体系、检测波长进行考察，选择Agilent XDB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、AQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、LunaOmega C18色谱柱(50 mm×2.1mm，1.6 μm)对样品进行色谱分析，发现使用Agilent XDB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)分离色谱图较好；考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液等流动相的色谱分离效果，结果以乙腈-0.05%为流动相，色谱峰峰形尖锐，分离效果最佳，基线平稳，保留时间适中；将(R，S)-告依春、虎杖苷、连翘酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、连翘苷、大黄素、齐墩果酸、熊果酸的对照品溶液分别注入液相色谱仪，在200～400 nm进行全波长扫描，结果最大吸收波长分别为 245 nm[(R，S)-告依春]、306 nm(虎杖苷)、330 nm(连翘酯苷A)、210 nm(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d)、277 nm(连翘苷)、254 nm(大黄素)、210 nm(齐墩果酸、熊果酸)。根据各检测成分紫外吸收的吸收峰特征，选择不同时段220、310 nm 2波长切换法进行测定，峰形相对较好，包含色谱信息较多，因此，确定检测波长为220、310 nm。

3.2 提取方式的优化

预实验比较了不同提取溶剂的提取效果，以不同体积分数乙醇(100%、75%、30%)和水为提取溶剂时，色谱峰基线出现漂移现象，基线不平稳；以甲醇(100%、75%、30%)为提取溶剂时，75%甲醇对各组分的提取效率较高。提取方法的考察，预实验比较了超声提取法和加热回流法对各组分提取效果的差异，结果加热回流提取法对各组分的提取较充分，特别是虎杖苷、大黄素、齐墩果酸、熊果酸4个成分含量差别较明显，为了使提取完全，故最终采用加热回流作为提取法。

3.3 样品测定结果分析

中成药化学成分较复杂，其疗效不是多个化学成分药用作用的简单相加，指纹图谱技术可对中药制剂进行整体性评价，对制剂质量控制有针对性和合理性[9-12]。本研究采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)建立了该制剂指纹图谱，12批样品相似度均大于0.95，表明疏风解毒胶囊的批间差异较小、质量较稳定。所生成指纹图谱的共有模式有22个共有峰，其中指认了(R，S)-告依春、虎杖苷、连翘酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、齐墩果酸、熊果酸、连翘苷、大黄素9个共有峰。9个成分含量测定结果显示，虎杖苷质量分数为8.314～6.058 mg·g-1，标准规定不得少于3.0 mg/粒(5.769 mg·g-1)，均符合规定；连翘苷质量分数为1.314～0.856 mg·g-1，标准规定不得少于0.20 mg/粒(0.384 mg·g-1)，均符合规定；(R，S)告依春质量分数为0.642～0.427 mg·g-1，柴胡皂苷a质量分数为2.424～1.857 mg·g-1，柴胡皂苷d质量分数为2.364～1.699 mg·g-1，连翘酯苷A质量分数为2.562～1.897 mg·g-1，大黄素质量分数为4.629～2.965 mg·g-1，齐墩果酸质量分数为2.047～1.179 mg·g-1，熊果酸质量分数为2.689～1.286 mg·g-1，不同批次间各组分含量存在一定差异，考虑与不同生产时间各批次间原药材质量差异有关。

本实验建立了疏风解毒胶囊UPLC指纹图谱，并同时测定9个成分的含量，方法稳定简单，能系统快速地评价疏风解毒胶囊的药品质量，对全面控制疏风解毒胶囊的质量具有指导意义。