Box-Behnken响应面法优化滇黄精产地加工炮制一体化工艺对黄精多糖的影响△

金鹏程，吴丽华，吴昕怡，李智敏，田浩，肖丹*

1.云南省农业科学院 药用植物研究所，云南 昆明 650205；2.云南省农业科学院 农产品加工研究所，云南 昆明 650221；3.云南省农业科学院 热区生态农业研究所，云南 楚雄 651300

中药材产地加工是指在药材基原植物的最佳采收年限、采收期内对其进行采收，在采收地进行去除非药用部位、清洗、分级挑选、切制、浸漂、蒸制、煮制、发汗、干燥、分割部位、包装等1个或多个加工炮制步骤[1-3]，是中药产业链中原料与饮片的中间环节[4]，也是保证和提高药材质量的重要环节[5-6]。滇黄精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.为百合科黄精属植物，味甘，性平，归脾、肺、肾经，主要用于脾胃气虚、内热消渴、肺虚燥咳等[7]，临床多用于改善心肺功能，治疗糖尿病、脂肪肝，延缓衰老[8-10]。黄精多糖为滇黄精的主要有效成分，也是《中华人民共和国药典》2020年版中滇黄精的质量评价指标[7]。

目前，滇黄精产地加工大多采用自然晒干，自然环境与晾晒条件等因素对药材品质影响较大。不同加工炮制方法得到的滇黄精质量参差不齐，存在加工过程耗时长、药材易霉变、黄精多糖含量降低等问题[11-13]。为提高滇黄精药材质量、减少黄精多糖的损失，需要对其产地加工炮制一体化工艺开展研究。目前，滇黄精产地加工多运用传统单因素试验和正交试验法[14-18]。响应面优化法相对于传统方法，可全面系统考察因素与因素之间、因素与响应面之间的交互作用[17]。现有关Box-Behnken响应面法优化滇黄精产地加工炮制一体化工艺对黄精多糖的影响文献鲜有报道。因此，本研究采用单因素试验与响应面优化相结合的方法，以黄精多糖作为评价指标，优化滇黄精产地加工炮制一体化工艺，为滇黄精药材产地加工炮制一体化提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UV-5500型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；XMTD-7000型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；150B型中药材粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)；FA1004型万分之一电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.2 试药

D-无水葡萄糖对照品(批号：110833-201707，纯度：99.9%，中国食品药品检定研究院)；无水乙醇、蒽酮、浓硫酸均为分析醇；水为纯化水。

滇黄精均由玉溪市祥馨农业技术开发有限公司种植，经云南省农业科学院药用植物研究所张金渝研究员鉴定为百合科黄精属植物滇黄精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.。

2 方法与结果

2.1 预处理

取基地种植的3 年生滇黄精植株，去除地上部分，取根茎部，去除泥沙、须根，洗净备用。

2.2 黄精多糖测定

2.2.1对照品溶液制备 精密称取对照品D-无水葡萄糖33.0 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

2.2.2标准曲线制备 精密量取D-无水葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置20 mL刻度试管中，加水至2.0 mL，摇匀，置冰水浴中，缓慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度，混匀，沸水浴10 min，取出，立即冰水浴10 min。按紫外-可见分光光度法，以纯化水为空白对照，在582 nm处测定吸光度(A)。

2.2.3线性关系考察 按照2.2.2项下方法，测定A。以A为纵坐标(Y)，黄精多糖质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=0.004 4X+0.063 5(r=0.997 6)，表明D-无水葡萄糖在0.033～0.198 mg·mL-1线性关系良好。

2.2.4供试品溶液制备 精密称取60 ℃干燥至恒重的供试品粉末0.250 0 g，置圆底烧瓶中，加入80%乙醇150 mL，浸泡30 min，置沸水浴中加热回流1 h，趁热过滤，滤渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，将残渣和滤纸置烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流1 h，趁热过滤，滤渣和烧瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，合并滤液，冷却，移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置10 mL具塞试管中，加水至2 mL，摇匀，冰水浴中缓慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度，混匀，沸水浴10 min，取出，立即冰水浴10 min。按紫外-可见分光光度法，在582 mm波长处测定A。

2.2.5精密度试验 精密量取D-葡萄糖对照品溶液0.5 mL，以纯化水为空白对照，在582 nm波长处测定A，RSD为0.46%，表明方法精密度良好。

2.2.6稳定性试验 取同一供试品溶液，以纯化水为空白对照，分别在0、2、4、6、8 h测定A，RSD为0.77%，表明样品稳定性良好。

2.2.7重复性试验 精密称取滇黄精供试品粉末6份，每份0.25 g，按2.2.4项下方法制备供试品溶液，以纯化水为空白对照，在582 nm波长处测定A，RSD为0.55%，表明方法重复性良好。

2.2.8加样回收率试验 取已知黄精多糖含量的滇黄精样品6份，每份0.25 g，按2.2.4项下方法制备，分别于具塞试管中加入对照品溶液1 mL，在582 nm波长处测定A，计算加样回收率，平均加样回收率为97.54%，RSD为0.90%，表明该方法准确度良好。

2.3 单因素试验

2.3.1蒸制时间 取按2.1项下方法净制的滇黄精鲜品，分别蒸制5、10、15、20、25、30 min，切3 mm厚片，60 ℃干燥至水分<15%，考察不同蒸制时间对滇黄精中黄精多糖含量的影响。如图1所示，蒸制时间为5～20 min时，黄精多糖含量随蒸制时间增加，20 min时达到最大值，此时，黄精多糖质量分数为11.55%；蒸制20～30 min，黄精多糖含量随蒸制时间增加而下降。因此，选择20 min为最佳蒸制时间；10、30 min为后续优化实验的最低、最高水平。

图1 不同蒸制时间下黄精多糖质量分数

2.3.2切片厚度 取按2.1项下方法净制的滇黄精鲜品，蒸制20 min后，分别切片1、2、3、4、5 mm，60 ℃干燥至水分<15%，考察滇黄精切片厚度对黄精多糖含量的影响。如图2所示，切片厚度为1～3 mm时，黄精多糖含量随片厚增加而增大；切片厚度达3 mm时黄精多糖含量达到最大值；切片厚度为3～5 mm时，黄精多糖含量随片厚增加呈下降趋势。因此，选择3 mm为滇黄精最佳切片厚度；1、5 mm为后续优化试验的最低、最高水平。

图2 不同切片厚度下黄精多糖质量分数

2.3.3干燥温度 取按2.1项下方法净制后滇黄精鲜品，蒸制20 min、切制成3 mm厚片，分别按30、40、50、60、70、80、90、100 ℃干燥至水分<15%，确定不同干燥温度对黄精多糖的影响。如图3所示，干燥温度为40～60 ℃时，黄精多糖含量随干燥温度的增加而增加；60 ℃时黄精多糖含量达到最大值；60～100 ℃时，黄精多糖含量随干燥温度增加呈下降趋势。因此，选择60 ℃为滇黄精最佳干燥温度，40、80 ℃为后续优化试验的最低、最高水平。

图3 不同干燥温度下黄精多糖质量分数

2.4 响应面法优化试验

2.4.1试验设计及结果 根据单因素试验结果和Box-Behnken响应面试验设计原理，选取3个因素为自变量，分别为蒸制时间(A)、切片厚度(B)、干燥温度(C)，每个因素取3个水平，以黄精多糖含量为响应值，设计中心组合试验。各因素及水平设计见表1。采用Design-Expert 8.0.5b软件设计Box-Behnken响应面试验设计方案，方案与结果见表2。共考察17组工艺参数，其中13～17组为中心设计(零点试验)。

表1 滇黄精加工炮制工艺Box-Behnken试验设计因素与水平

表2 滇黄精加工炮制工艺Box-Behnken的试验设计方案与结果

2.4.2方差分析及数据处理 回归模型方差分析及回归系数显著性检验结果见表3，拟合得到回归方程为Y=0.138+0.012A+0.059B+0.023C+0.60×10-4AB-0.238×10-4AC+0.306×10-4BC-0.246×10-3A2-0.855×10-2B2-0.186×10-3C2，P<0.01，r为0.990 5，表明该模型对本实验的拟合度较好，在本实验研究范围内差异有统计学意义。

表3 滇黄精加工炮制工艺回归模型方差分析结果

因素B、B2、C2对响应值的影响差异有统计学意义(P<0.001)，因素A、C、A2对响应值的影响差异有统计学意义(P<0.05)，因此，滇黄精产地加工各因素对黄精多糖的影响不是简单的线性关系，A、B、C 3个因素之间存在显著交互作用。本模型极显著(P<0.000 1)，失拟项P=0.818>0.05，差异无统计学意义，说明该回归模型与实验数据拟合程度良好、试验误差小，可以采用其优化滇黄精产地加工炮制一体化工艺。

运用Design-Expert 8.0.5b软件进行数据拟合，3D图直观体现A、B、C 3个因素之间两两交互作用对黄精多糖含量的影响，结果见图4～6。滇黄精A、B交互作用响应面3D图坡度平缓，表明这2个因素交互作用较弱，对黄精多糖含量影响较小。滇黄精C与A、C与B交互作用响应面3D图坡度较陡，表明C与A、C与B交互作用较强，对黄精多糖含量影响显著。根据Design-Expert 8.0.5b软件分析计算，滇黄精产地加工炮制一体化优化工艺为A：22.24 min、B：3.66 mm、C：61.19 ℃，预测黄精多糖质量分数为12.29%。

图4 多糖提取率随蒸制时间和切片厚度变化的响应面

图5 多糖提取率随干燥温度和蒸制时间变化的响应面

图6 多糖提取率随干燥温度和切片厚度的变化的响应面

2.5 验证实验

根据2.4.2项下优化工艺及实际操作条件调整为滇黄精净制样品A:22 min、B:3.6 mm、C:61 ℃，制备3 批样品，分别测定黄精多糖质量分数，平均值为12.21%，与相应条件预测值相接近。结果表明，本研究所建立的数学模型准确可靠，滇黄精产地加工炮制一体化优化工艺重复性好、可行性高、可操作性强。

3 讨论

中药材产地加工炮制一体化是原料到饮片且控制药材质量的重要环节之一[1-2]。目前，产地加工仍处于传统经验指导操作，因此，对各步骤过程应做到科学、规范和标准，为中药原料质量提供保障[3-5]。本研究对滇黄精蒸制时间、切片厚度、干燥温度进行单因素考察，确定后续响应面分析各因素最高水平和最低水平。通过对黄精多糖含量测定，选择蒸制时间22 min、切片厚度3.6 mm、干燥温度61 ℃作为优化工艺。按优化工艺制备测定的黄精多糖实际值与预测值相接近。结果表明，本研究所建立的数学模型准确可靠，优化后滇黄精产地加工炮制一体化工艺重复性好、可行性高、可操作性强，具有实际意义。滇黄精产地加工炮制一体化对滇黄精原料生产和饮片加工环节进行了优化，能够有效减少黄精多糖的损失、保证药材质量，为中药饮片、中药制剂做好原料质量保障。