前列腺癌中CD147、MMP-2 mRNA表达与临床分期、病理学分级的关系

吴狄 邓海媚 姚睿智 陈铭

前列腺癌（prostate cancer，PCA）为前列腺泡细胞异常无序生长而产生的恶性肿瘤，其在全世界范围内发病率位居第二位，死亡率位居第六位［1］。近年来我国前列腺癌发病率呈显著上升趋势［2］，如何提高其早期诊断水平是目前研究热点。肿瘤的发生、生长失控及浸润和转移为一个涉及多因素、多步骤的复杂过程，而细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloprotein-ase inducer，EMMPRIN）又称为CD147，作为一种重要的跨膜糖蛋白，CD147 在肿瘤生长、浸润与转移等过程中均发挥着重要作用。其在多种肿瘤细胞中均有不同程度表达，可能与其促进肿瘤生长有密切关系，是目前肿瘤研究的新兴热点［3］。基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase，MMP-2）属于明胶酶，为基质金属蛋白酶的一种，可特异性破坏基底膜，同肿瘤转移有密切关系，对判断疾病病情进展有指导意义［4］。但目前关于CD147、MMP-2 在前列腺癌中的表达现状研究较少。本文将评估CD147、MMP-2 在前列腺癌中的临床意义，旨在为临床准确诊断前列腺癌提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年4月至2018年12月本院收治的前列腺癌患者58 例及同期行手术治疗的前列腺增生患者50 例为研究对象。前列腺癌纳入标准：①均符合前列腺癌诊断标准［5］，且在术前未接受内分泌治疗或放化疗；②入院时Gleason 评分在2 分及以上，TNM 分期T1～4 期；③知情同意本研究并签署知情同意书。排除标准：①其他类型恶性肿瘤患者；②病历资料不全；③配合依从性差者。58 例前列腺癌：年龄平均（60.15±6.18）岁；临床分期：T1～T2 期31例，T3～T4 期27 例；病理学分级2～4 级31 例，≥5 级27 例；淋巴结转移N0 期30 例，N1 期28 例；远处转移M0 期30 例，M1 期28 例。另选择同期行前列腺摘除术与经尿道前列腺电切术的良性前列腺增生患者50 例，年龄平均（60.11±6.24）岁，均知情同意本研究。本研究获得院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

术中收集前列腺癌患者的病灶组织、癌旁组织及前列腺增生患者的组织标本。将所有前列腺组织以石蜡包埋，每张切片0.5 μm，连续切片5张，压片烘干后标记上病例编号。

1.2.2 实验试剂

CD147mRNA 原位杂交试剂盒与地高辛标记的CD147 相关寡核苷酸探针均购自武汉博士德公司；MMP-2mRNA PCR 检测试剂盒购自日本TaKaRa 公司。

1.2.3 检测方法

CD147mRNA 以焦炭酸二乙酯（DEPC）清洗原位杂交试验中的器皿、蒸馏水。阴性对照组中只加杂交液，不加探针。检测步骤：将石蜡切片进行脱蜡和水化，应用3%H2O2将过氧化物灭活，以蛋白酶K 进行消化处理，暴露mRNA 的核酸片段，以预杂交封闭片段上非特异性杂交点，后进行二次杂交，以地高辛标记的CD147 探针处理。杂交后，去除非碱基配对RNA，以抗体连接，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，常规采用苏木精复染，后脱水，透明，封片。MMP-2mRNA：依据试剂盒说明书提取RNA，逆转录获得cDNA，将cDNA 扩增为MMP-2，以β-actin 为内参，PCR 反应条件：95℃30 s，循环42 次；95℃5 s，循环42 次；60℃，45 s，循环42 次。以-2△△CT法计算mRNA 相对表达强度，重复测定3 次后取平均值。

1.2.4 病理结果的判读

由2 名经验丰富的病理医师进行评判，细胞膜与细胞质内出现淡黄色或棕黄色为阳性细胞，以半定量积分法［6］对原位杂交结果进行判断，其中染色强度为浅黄色记1 分，深黄色记2 分，棕黄色记3分，随机找到5 个400 倍的视野进行观察，统计阳性细胞在视野范围内占比，阳性细胞率<5%记1分，阳性细胞率在5%～25%记2 分，阳性细胞率在26%～50%记3 分，阳性细胞率>50%记4 分。以上述两部分分值之和作为最终总分，总分1～3 分为阴性（-），4～6 分为阳性（+），7 分为强阳性（++），阳性率=（阳性+强阳性）/总例数×100%。如图1。

图1 病理结果判读（SP，×400）Figure 1 Interpretation of pathological results（SP，×400）

1.2.5 资料搜集

搜集前列腺癌患者的临床资料，包括年龄、临床分期、病理学分级、淋巴结转移、远处转移等，分析前列腺癌患者病灶组织中CD147、MMP-2mRNA 表达水平与各参数的关系。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0 软件处理数据，计数资料以n(%)表示，采用χ2检验，计量资料以（）表示，采用配对样本t检验或独立样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同组织中CD147、MMP-2mRNA表达水平比较

前列腺癌病灶组织中CD147mRNA 阳性率及MMP-2mRNA 表达水平高于前列腺癌癌旁组织、前列腺增生组织（Z值=16.207，t配对=17.771，P<0.05），前列腺癌癌旁组织CD147mRNA 阳性率及MMP-2mRNA 表达水平也高于前列腺增生组织（χ2=4.776，t独立=23.193，P<0.05）。见表1。

表1 不同组织中CD147、MMP-2 mRNA 表达水平比较［n（%）］Table 1 Comparison of CD147 and MMP-2 expression levels in different tissues［n（%）］

2.2 CD147、MMP-2 mRNA表达水平与各参数的关系

前列腺癌患者临床分期T3～T4期、病理学分级≥5级、淋巴结转移N1 期、远处转移M1 期者的CD147mRNA 阳性率及MMP-2 表达水平高于临床分期T1～T2期、病理学分级2～4级、淋巴结转移N0期、远处转移M0期者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 CD147 mRNA、MMP-2 mRNA 表达水平与各参数的关系［n（%）］Table 2 Relationship between CD147 mRNA，MMP-2 mRNA and various parameters［n（%）］

2.3 电泳结果

电泳结果显示，前列腺癌病灶组织中CD147mRNA、MMP-2mRNA 表达水平较前列腺癌癌旁组织、前列腺增生组织高。见图2。

图2 电泳结果Figure 2 Electrophoresis results

3 讨论

肿瘤的发生是多个基因协调作用的结果，其主要含原癌基因的表达上调及抑癌基因的表达下调。研究发现，前列腺癌的发生可能与遗传、环境、性激素、基因调控异常等有关，其中基因异常在前列腺癌发生发展中扮演重要角色，不仅能促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，也可促进肿瘤细胞向周围组织、远处器官及淋巴结转移［7］。本研究结果与邹桂成等［8］的报道结果（前列腺癌癌组织、前列腺癌癌旁组织、前列腺增生组织CD147 mRNA 阳性率分别为95.08%、32.79%、16.32%）一致，表明CD147 在前列腺癌患者病灶组织中呈高表达状态。正常组织上皮细胞由一层基底膜及躯体其他部位隔离开，正常细胞无法突破这一层基底膜屏障，而肿瘤细胞经刺激基质细胞释放基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）可破坏基底膜屏障。在前列腺患者中随病理分级增加，其恶性程度升高，而基底膜缺失也越大，当肿瘤增大到一定程度时，获得生成血管能力，这为前列腺上皮肉瘤演变为浸润性肿瘤提供了良好条件。CD147 作为一种细胞外基质类金属蛋白酶型诱导分子，可刺激前列腺癌患者外周间质细胞，促进其生成MMPs，继而使前列腺癌病灶组织中MMPs 水平升高，活性增强，有利于降解细胞外部基底膜与间质等成分，促进了前列腺癌的发生发展［9］。Liang 等［10］的研究也发现，CD147 的DNA 启动子低甲基化可能是与癌症相关的CD147 过度表达相关调节机制之一，并可能在前列腺癌发生中起到关键作用。但本研究前列腺癌病灶组织中CD147 mRNA 阳性率较邹桂成报道的略低，可能因患者配合度差或所采用的检测方法灵敏度不一等因素有关，因此原位杂交法检测CD147 mRNA 的灵敏度仍有待提高。此外本研究结果说明在前列腺癌中MMP-2 表达水平上升，MMP-2 可能在酶解基底膜与细胞间基质成分中起着“钻头”作用，因此也与前列腺癌的发生发展密切相关［11］。

本研究也发现，前列腺癌患者中，临床分期T3～T4 期、病理学分级≥5 级、淋巴结转移N1 期、远处转移M1 期的CD147 mRNA 阳性率及MMP-2 表达水平较临床分期T1～T2 期、病理学分级2～4 级、淋巴结转移N0 期、远处转移M0 期者高，与既往研究［12-13］一致，说明前列腺癌患者病灶组织中CD147、MMP-2mRNA 的表达水平与临床分期、病理分级、淋巴结转移及远处转移等关系密切。此外CD147 也能与MMP-2 等形成复合物，而粘附到肿瘤细胞表面，加强对肿瘤细胞外基质与基底膜的降解，增加肿瘤细胞侵袭力，并诱导血管内皮生长因子生成，介导肿瘤转移等生物学过程［14-15］。

综上所述，检测前列腺癌患者病灶组织CD147、MMP-2 mRNA 有助于推断其临床分期、病理学分级及淋巴结转移、远处转移等情况，值得在临床推广实践。