复幼颗粒提取工艺优化及制剂处方研究

庞琳诺，马葆睿，张萌，张欢，覃柳莹，蔡梦如，赵立波，王晓玲*，倪健

(1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.首都医科大学附属北京儿童医院，北京 100045；3.北京中医药大学中医药研究院，北京 100029)

性早熟是一种常见的青春期发育异常疾病，在女童中的发病率远高于男童[1]，性早熟儿童由于体内性激素水平升高，性器官过早发育[2]，体格加速增长、骨骺提前闭合，导致最终成人身高低于正常同龄人身高[3]，随着生活水平的提高，我国儿童性早熟发病率逐年上升[4]，性早熟的预防和治疗愈发受到人们的重视。

复幼方为首都医科大学附属北京儿童医院的临床经验方，化裁自知柏地黄丸，经剂型优化制成。全方由盐知母、生地黄、玄参、牡丹皮、关黄柏等11味中药组合而成，具有滋补肝肾、清热泻火的作用，用于治疗肝肾不足、阴虚火旺、肝郁化火所致女童性早熟，症见乳房增大、白带量多、阴道出血等效果显著。原处方为合剂供患儿服用，疗效确切[5]，但存在携带和使用不便、口感较差、易发霉变质等缺点，将剂型制备成颗粒剂，载药量大、稳定性好，通过矫味可以提高患儿顺应性。

本研究首先采用正交实验，以芒果苷、芍药苷含量及干膏得率为指标，优选了加水倍量、提取时间和提取次数，以指标性成分的损失率为评价指标对浓缩和干燥工艺进行了考察，对辅料、润湿剂和矫味剂种类及用量等进行了优选，并对颗粒吸湿性进行考察，为复幼颗粒规模化生产的控制条件提供参考。

1 仪器和试药

1.1 仪器

FW-200型粉碎机(北京科委永兴仪器有限公司)；ZDHW型电热套(北京市中兴伟业仪器有限公司)；DZF-6050型干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；RE-52A型旋转蒸发器(海振捷实验设备有限公司)；JY5002型电子天平(0.01 g，上海衡平仪器仪表厂)；CPA225D型电子分析天平(0.01 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司；LC-20AT型高效液相色谱仪(SPD-20A DAD检测器，LC Solution色谱工作站，日本岛津公司)；DHG-9145A型鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、10目药筛、80目药筛、干燥器、称量瓶、喷雾瓶等。

1.2 试药

盐知母、生地黄、玄参、牡丹皮、关黄柏等药材均购自北京本草方源药业有限公司。芒果苷(批号：111607-201704，纯度：98.10%)；芍药苷(批号：110736-201842，纯度：97.4%)，均购自中国食品药品检定研究院。糊精、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、糖精钠、阿斯帕坦均为药用辅料，娃哈哈水、乙腈和甲醇为色谱纯，实验用水为高纯水，其余化学试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺

2.1.1 正交实验设计

全方采用水提工艺，以芒果苷及芍药苷提取率为考察指标，设计正交实验优选最佳水提工艺。因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.2 提取液中芒果苷和芍药苷含量测定

2.2.1 色谱条件

流动相：乙腈-0.2%醋酸溶液(9:91)，检测波长：258、 230 nm，流速：1.0 mL·min-1，进样量：10 μL。此条件下对照品溶液和供试品溶液的HPLC图,见图1和图2。

注：A：对照品溶液；B：供试品溶液；1：芒果甘。图1 芒果苷HPLC图

注：A：对照品溶液；B：供试品溶液；1：芍药苷。图2 芍药苷HPLC图

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取芒果苷对照品和芍药苷对照品适量，分别加甲醇制成浓0.050 33 mg/mL的芒果苷对照品溶液和0.059 80 mg/mL的芍药苷对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

按照处方比例称取药材，加水进行提取、滤过，放冷定容，摇匀，静置。取少量过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.4 阴性供试品溶液的制备

按照处方比例称取药材两份，一份不含知母，另一份不含牡丹皮，其余按照上述供试品溶液的制备方法，即得。

2.3 水提取正交试验及结果

按处方比例称取药材9份，根据正交试验表加入规定量的水进行回流提取，滤过，合并滤液，放冷，定容至合适的体积，摇匀。进样检测，记录峰面积，计算芒果苷及芍药苷的提取率，用SPSS软件对数据进行处理，筛选出最佳提取工艺。结果见表2、表3、表4。

表2水提工艺直观分析表中， A、B、C项下K1、K2、K3值代表各因素分别采用3个不同水平时指标性成分提取率的总和，R值代表K1、K2、K3的极差，即最大数据与最小数据的差值，D为空白列，无因素作用，不进行分析。以芒果苷为指标时，A加水量项下的K1值为加水量为8倍时芒果苷提取率的总和，即176.89=47.98+64.98+63.93，R值为K3与K1的差值，即40.92=217.81-176.89。R值的大小提示各因素对芒果苷和芍药苷提取率的影响大小依次均为：提取次数(因素C)>加水量(因素A)>提取时间(因素B)。由表3、表4两指标性成分方差分析表可知，提取次数(因素C)对芒果苷和芍药苷提取率的影响均有统计学意义(P<0.05)，而加水倍量(A)和提取时间(B)的影响则无统计学意义(P>0.05)，结合表2中K值大小，因素A加水量选择K3，因素B提取时间选择K1， 因素C提取次数选择K3，因此，最优工艺确定为A3B1C3，即加12倍量水，提取3次，每次1 h，进行验证试验。

表2 水提工艺直观分析表

表3 芒果苷提取率方差分析表

表4 芍药苷提取率方差分析表

2.3.1 验证试验

按处方比例3份药材，按最优工艺A3B1C3进行工艺稳定性验证试验。实验结果表明干膏得率均值为36.31%，RSD为0.58%;芒果苷提取率均值为88.06%，RSD为0.23%;芍药苷提取率均值为94.69%，RSD为1.66%。可见该提取工艺浸膏和指标性成分收率高，重复性好，可为大规模生产提供参考。

2.4 浓缩工艺和干燥工艺的考察

2.4.1 浓缩工艺考察

按处方比例称取药材，按最优工艺进行提取。精密量取3份等体积水提液，分别在60、70、80 ℃条件下减压浓缩至相对密度1.10～1.20，放冷后分别加水复溶至2 000 mL，搅拌均匀。剩余药液作为空白。测定芒果苷和芍药苷的含量，计算不同温度浓缩后指标性成分损失率。试验结果见表5。

表5 水液浓缩温度考察(n=3)

三个温度条件下进行减压浓缩，芒果苷的损失率在10%以上，均较高；芍药苷几乎没有影响，但综合考虑，在生产中需要注意控制浓缩温度。

2.4.2 干燥工艺的考察

按优选的提取工艺和浓缩工艺得到稠膏，称取等重量稠膏10份，取9份分别于60、70、80 ℃条件下减压干燥，得干浸膏，另一份为参比组，用于计算干燥前含量。干浸膏与参比组均加水复溶至等体积，搅拌均匀。测定芒果苷和芍药苷的含量，计算不同温度干燥后指标性成分损失率。试验结果见表6。

表6 干燥温度考察(n=3)

三个温度条件下进行减压干燥，芒果苷的损失率均较高；60 ℃时芍药苷的损失率在10%以下，故确定温度在60 ℃。在实际生产中应尽可能降低浓缩液的干燥温度。

2.5 成型工艺研究

2.5.1 药辅比的确定

根据水提工艺研究的结果，每个处方的出膏量约为26 g，按0岁儿童最小服用量计算，每日3次，每次需服药约3 g，选择药辅比1∶1进行制粒。

2.5.2 辅料的筛选

2.5.2.1 浸膏粉及辅料吸湿百分率的测定

选取颗粒剂中常用的辅料糊精、乳糖、可溶性淀粉进行吸湿率考察，为筛选辅料提供依据，按药辅比1∶1分别将浸膏粉与各辅料混匀，精密称量约2 g，置于干燥至恒重的称量瓶中，铺平，置于相对湿度为75%的盛有 NaCl过饱和溶液的干燥器中，于25 ℃室温下放置，按时称量，计算吸湿百分率。结果见表7、图3。

实验结果表明浸膏粉吸湿性较强，放置72 h后，吸湿率接近17%。加入上述辅料后，吸湿性均得到了改善，糊精与可溶性淀粉的防潮性相近，略优于糖粉，为进一步筛选辅料提供了依据。

图3 浸膏粉及辅料吸湿百分率曲线

表7 浸膏粉及辅料吸湿百分率(%)

2.5.2.2 辅料种类考察

分别称取浸膏粉和各辅料，按药辅比1∶1混合均匀，加入95%乙醇制软材，过14目筛整粒，60 ℃以下干燥，观察软材性状、颗粒外观性状及过筛难易程度，结果见表8。

表8 辅料种类考察

通过对三种辅料的考察，结果发现加入糊精和乳糖后，均能较好的制粒成型，加入糊精后颗粒的成型率较高，而加入可溶性淀粉后，颗粒较为松散、细粉较多，不易成型，因此，选用药用糊精作为制粒时的辅料。

2.5.3 润湿剂乙醇浓度的考察

称取适量浸膏粉与糊精，按药辅比1∶1混合均匀，分别喷入不同浓度的乙醇制粒，综合软材性状、制粒难易程度及颗粒的性状、粘结情况等进行分析。实验显示，喷入90%乙醇，少量醇的加入便可使浸膏粉结块，提示乙醇浓度低，未考察85%乙醇。喷入95%乙醇，软材松软无结块，可完全通过筛网，三批所得颗粒成型较好。因此可以考虑在制粒时选择95 %乙醇为润湿剂。

2.5.4 矫味研究

处方中含有龙胆、关黄柏、夏枯草等苦味药及动物药鳖甲，口感和气味不佳，儿童服用顺应性差，计划采用加入甜味剂和香精的方式进行矫味，并对甜味剂种类、加入量以及香精的种类进行筛选，从而改善颗粒剂的口感和气味。

采用经典人群口尝评价法对颗粒剂进行口感评价，参考相关文献[6-8]，选择12名健康志愿者为受试者，评价前温水漱口，品尝时在口中作漱口动作，停留10 s后吐出，口感分为入口、10 s内味道及口腔残余后味，根据口感进行打分，品尝完一种溶液后漱口至无味道残留，再品尝下一种溶液。

2.5.5 甜味剂种类考察

阿司帕坦、甜蜜素、甜菊素、糖精钠、纽甜等高甜度甜味剂可以改善中药制剂的的苦味[9]，称取等量的浸膏粉，分别加入不同种类相同比例的甜味剂，加入200 mL热水搅拌均匀，经口尝后记录口感，结果见表9。

表9 不同种类甜味剂口感评价结果

2.5.6 颗粒组成的考察

WHO规定阿司帕坦的日摄取量不超过40 mg/kg[10]，以0岁儿童体重3.2 kg计，阿司帕坦的添加量应小于0.7%。经前期实验初步确定了4种不同的颗粒组成，加入0.5%的阿司帕坦，用20倍体积热水溶解后，经口尝进一步进行口感评价，规定组成为浸膏粉：糊精1∶1(编号1)的颗粒苦度级别为10。结果见表10。

表10 不同组成颗粒的口感评价结果

经口尝评价得知，优先顺序为4>5>3>2，与苦度级别评分一致。浸膏粉味道极苦，加入β-CD后可以改善入口味道，后味仍苦，蔗糖含量高的颗粒整体口感最佳。考虑到为儿童用药，应在改善口感的同时尽可能减少蔗糖用量，因此颗粒组成为浸膏粉：糊精：蔗糖10∶3∶7，加入阿司帕坦0.5%。冲泡后气味不佳，考虑加入香精，提高儿童服药的顺应性。

2.5.7 香精种类的考察

称取一定质量的颗粒(浸膏粉：糊精：蔗糖10∶3∶7，阿司帕坦0.5%)，添加颗粒重量0.2%的不同种类的香精，加入20倍体积的热水溶解后，口尝记录气味和口感，结果见表11。

表11 香精种类的气味和口感评价结果

结果表明，甜橙香精气味清香，可以较好地改善颗粒口感。结合矫味研究的口尝结果，确定颗粒组成为50%浸膏粉、35%蔗糖、15%糊精，加入颗粒重量0.5%阿司帕坦和0.2%的甜橙香精制粒。

2.6 颗粒临界相对湿度的测定

考察环境湿度对颗粒生产的影响，配制不同种类盐和水的过饱和溶液，分别置于7个玻璃干燥器中，于室温下放置24 h以保持一定的相对湿度。将称量瓶干燥至恒重，精密称定实验室自制的复幼颗粒装入称量瓶，打开瓶盖，分别放入上述7种不同相对湿度的干燥器中，平行操作两份，密闭，置于稳定环境中(25 ℃)放置7 d，取出，盖严，精密称重。

记录复幼颗粒吸湿前后的质量变化并计算复幼颗粒吸湿率，结果见表12。绘制吸湿平衡曲线并求出临界相对湿度(CRH)，结果见图4。

表12 复幼颗粒不同相对湿度下的吸湿率(%)

图4 复幼颗粒临界相对(CRH)湿度曲线

结果表明，复幼颗粒的临界相对湿度约为80%。因此，在进行混合、制粒操作时，周边的环境湿度应尽量控制在80%以下，以免湿度过高导致吸湿，影响制粒效果。

3 讨论

性早熟的治疗常选用促性腺激素释放激素类似物(Gonadotropin-releasing hormone analogue，GnRHa)[11]，但其价格昂贵，长期服用易产生不良反应[12]。因此，对于临床症状较轻微的患儿不宜采用过于积极的西药治疗[13]。

研究表明，治疗儿童性早熟的中药用药特点以清热泻火、滋阴凉血为主，兼以疏肝理气、化痰散结，使用频率最高的前5味中药为清热泻火药知母、清热凉血药生地黄和牡丹皮、清热燥湿药黄柏和清虚热药柴胡[14]。知柏地黄丸(知母、熟地黄、黄柏、泽泻、牡丹皮、茯苓、山茱萸、山药)源于《景岳全书》，具有滋肾阴、清相火的作用[15]，可以有效地抑制性早熟患儿发育[16-21]。复幼方在知柏地黄方的基础上化裁而成，用于女童性早熟的治疗。

复幼方由盐知母、生地黄、玄参、牡丹皮、关黄柏等11味中药组成，按照全方水提的工艺，根据2015版《中国药典》药材含量检测方法对指标成分进行选择，生地黄中梓醇极性大、出峰时间短，在复方中难以检测，毛蕊花糖苷及玄参、关黄柏等药材中的指标性成分在水提液中含量低，部分药材在药典中无规定含测成分。故选择君药盐知母中的芒果苷、佐使药牡丹皮中的芍药苷、丹皮酚作为指标性成分。

原方合剂采用水提的工艺未对加水量、提取次数和提取时间进行系统研究，为使提取工艺更加合理，采用正交实验，以干膏得率和芒果苷、芍药苷、丹皮酚含量为评价指标进行工艺优选，由于9个正交试验中丹皮酚提取率整体在20%左右，不符合要求，因此舍弃此成分作为指标成分，故未进行丹皮酚的结果分析。

浓缩工艺研究和干燥工艺研究中，芒果苷损失率较大，可能由于长时间加热，芒果苷分子发生结构变化所致[22]，提示在实际生产中应注意控制加热温度及加热时间。成型工艺研究结合实验室条件，采取湿法制粒，对辅料和矫味剂种类、润湿剂浓度、制粒难易程度、颗粒外观等进行了考察，确定制剂的最佳成型工艺。复幼颗粒作为儿童制剂，应改善原处方苦味药材所致口感不佳问题，应注意矫味剂的日摄取用量应符合药用辅料相关要求，香精的加入不仅能改善口感，还能使制剂气味易于接受。采用经典人群口尝评价法，可以根据实验需要采用不同方法，使实验结果更加客观[23]。最终确定复幼颗粒的制备工艺为，全方加12倍量水提取3次，每次1 h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成稠膏(相对密度1.10～1.20，60 ℃)，稠膏60 ℃减压干燥成干膏，干膏粉：蔗糖：糊精的比例为10∶7∶3，加入0.5%阿司帕坦、0.2%甜橙香精矫味，95%乙醇溶液为润湿剂制粒，环境湿度控制在80%以下。此方法稳定可行，为复幼颗粒的中试放大及生产条件控制提供了科学的实验依据。