环介导等温扩增技术、痰涂片镜检法及固体培养法诊断肺结核病的临床价值

龙璠 张湘

（四川省南充市第五人民医院检验科 南充 637100）

结核病是一种慢性呼吸道传染性疾病，主要由结核分枝杆菌引起，对人类健康造成较大危害，为三大传染病之一。临床控制结核病传播的关键在于早诊断、早治疗，但临床缺乏快速、高效的诊断方法，既往常用的痰涂片染色镜检法诊断效能较低，对结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌无法进行有效区分；培养法耗时长，不利于临床及时制定治疗方案[1～2]。临床诊断方法多样，但均存在一定弊端，亟需寻找快速、简便、准确率高的诊断方法，使肺结核病患者能够尽早确诊、尽早治疗，控制病情传播。环介导等温扩增技术能够在恒温条件下扩增，初用于临床时优势突出，操作简单、特异性高，能够在短时间内获得诊断结果[3]。鉴于此，本研究就环介导等温扩增技术、痰涂片镜检法及固体培养法诊断肺结核病的临床价值进行了分析。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年4月～2020年4月期间于本院就诊的182例初诊有肺结核可疑症状患者，其中男98例，女84例；年龄18～75岁，平均（46.31±10.59）岁。临床根据《肺结核诊断标准（WS288-2017）》[4]将入选者分为肺结核病组（n=106）与非肺结核病组（n=76），所有入选者依从性均较好。

1.2 研究方法 所有入选者均提供1份痰标本，进行痰涂片镜检法、固体培养法及环介导等温扩增技术检测。痰涂片镜检法采用直接涂片抗酸染色显微镜检测痰标本[5]。固体培养法：在痰标本中加入4倍体积的4%氢氧化钠溶液，摇匀后静置，当痰标本液化充分后，采用无菌吸管取3滴分布于罗氏培养基斜面的上、中、下部，将培养基放入培养箱中，设置温度37℃，之后每周观察1次，并记录观察结果[6]。环介导等温扩增技术：在痰标本中加入2倍体积的4%氢氧化钠溶液，摇匀后静置，当痰标本液化充分后，取1 ml放入1.5 ml离心管，离心10 min，速度为1 300 r/min，去除上清液，沉淀加入1 ml生理盐水悬浮，采用1 300 r/min的速度离心10 min，洗涤2次，仅保留沉淀物。之后将40μl核酸提取液加入离心管中，摇匀，用超过95℃的沸水浸泡10 min，冷却至室温后离心5 min，速度1 300 r/min。取20μl密封液与23μl聚合酶放入0.2 ml反应管，反应体系数目根据检测样本数据进行准备，并设置阳性、阴性对照，再在恒温扩增荧光检测仪上放置反应管，仪器将自动判断结果。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，在ABI PRISM 377DNA自动测序仪上对扩增产物进行测序，使用直接测序法，测序结果在NCBI网站进行比对分析。

1.3 观察指标 以临床诊断结果为参考，分析环介导等温扩增技术、痰涂片镜检法及固体培养法在肺结核病中的诊断效能，计算灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值。临床诊断结果为肺结核，痰涂片镜检法、固体培养法及环介导等温扩增技术也检出阳性的即为真阳性；若临床诊断结果为非肺结核，各方法检出的阳性即为假阳性。以n表示总例数，a表示真阳性，b表示假阳性，c表示假阴性，d表示真阴性。准确度=（a+d）/n×100%；灵敏度=a/（a+c）×100%；特异度=d/（b+d）×100%；阳性预测值=a/（a+b）×100%，阴性预测值=d/（d+c）×100%。

1.4 统计学处理 数据处理采用SPSS22.0统计学软件，计数资料以%表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

环介导等温扩增技术灵敏度、准确度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于痰涂片镜检法，环介导等温扩增技术灵敏度、准确度、阴性预测值均高于固体培养法，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1～表4。

表1 痰涂片镜检法诊断结果（例）

表2 固体培养法诊断结果（例）

表3 环介导等温扩增技术诊断结果（例）

表4 痰涂片镜检法、固体培养法及环介导等温扩增技术诊断效能对比[例（%）]

3 讨论

当前临床诊断肺结核病主要还是依赖结核杆菌培养与涂片抗酸染色，结核杆菌涂片法检出率通常为40%左右，诊断效能较差，结核杆菌培养检出率虽较涂片法更高，但其耗时较长，在早期诊断中效果较差[7]。传统的诊断方法均存在一定弊端，已无法满足临床对于诊断肺结核病的时效需求，需寻找其他更为理想的诊断方法[8]。

本研究结果显示，环介导等温扩增技术灵敏度、准确度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于痰涂片镜检法，灵敏度、准确度、阴性预测值也均高于固体培养法，表明肺结核病诊断中环介导等温扩增技术诊断价值较高，利于患者早诊断、早治疗，在结核病防治机构中应用前景较佳。痰涂片镜检法主要是依赖检验人员的识别能力从形态学进行鉴别，但菌体在个体发育中以多种形态存在，极易出现误诊、漏诊，诊断敏感度较低；固体培养法在进行处理时会对标本中50%～80%的结核菌活性造成损伤，以致阳性检出率较低[9]。环介导等温扩增技术对仪器设备要求不高，不需要用复杂、昂贵的检测设备，能够快速检出结核杆菌，在1 h内即可获得结果[10]。该项技术操作简单，在1个装置中就能完成所有反应，且反应装置为封闭状态可减少污染。环介导等温扩增技术针对结核分枝杆菌设置不同的引物，利用链置换反应，大量扩增目标DNA，扩增效率较高[11]。环介导等温扩增技术虽具有方便、快捷等突出优势，但在临床操作时仍需注意以下几点：因该项技术对设备要求不高，基层医院可进行相关检测，但需注意对工作人员的培训，以确保操作过程不要出现差错；该项技术实验过程中需进行阴性、阳性对照，为节约成本，应在每日痰标本＞10份的实验室中开展[12]。