冠心病患者循环lnc RNA Novlnc6表达及其与预后的相关性研究

陈雪梅 张玲

(汉中市人民医院心内科，陕西 汉中 723000)

冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病[1-3]。药物治疗仍然是冠心病的主要治疗策略之一，但药物治疗的应用受到药物耐受性的不良副作用的挑战[4-5]。因此，鉴定用于诊断冠心病的生物标志物对于改善冠心病的早期治疗具有重要意义。长非编码RNA(lncRNA)是一组含有超过200个核苷酸的非编码RNA。众所周知，lncRNAs几乎在人体的所有生物过程中都具有关键作用[6-7]。 LncRNA也被证明在各种人类疾病的发展和进展中发挥重要作用，包括不同类型的癌症，肝脏疾病和心脏病。Novlnc6作为lncRNA的成员，主要在心肌细胞以及内皮细胞中表达，并且在骨形态发生蛋白10(BMP10)的表达中具有调节作用，并且Novlnc6也被发现在急性心肌梗死进展中具有必要的功能，此外Novlnc6被证明能够调节血管生长和功能[8-9]。本研究拟探讨冠心病患者循环lnc RNA Novlnc6表达及其与预后的相关性研究，为冠心病的诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年12月至2017年9月在我内科确诊的冠心病患者96例为病例组，确诊。按照是否发生急性冠状动脉综合征分为稳定性冠心病组47例，急性冠脉综合征组49例。同期选择本院门诊正常体检者86例为对照组。冠心病组男50例，女46例，平均年龄(56.78±21.85)岁，平均病程(9.93±5.64)年，平均收缩压(126.74±19.35)mmHg，平均舒张压(79.74±14.91)mmHg，BMI(22.71±2.80)Kg/m2，吸烟45例，饮酒40例；对照男45例，女44例，平均年龄(57.24±19.14)岁，平均收缩压(123.55±22.56)mmHg，平均舒张压(76.56±12.65)mmHg，BMI(22.65±2.72)Kg/m2，吸烟39例，饮酒35例。纳入标准：符合《冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准(WS319-2010)》，经实验室检查(S-T段异常压低，一过性S-T段抬高，明显的S-T段压低和T波倒置等)及临床表现(突感心前区疼痛，疼痛从胸骨后或心前区开始，向上放射至左肩、臂，甚至小指和无名指，休息或含服硝酸甘油可缓解)。排除标准：孕妇或近3个月有手术、创伤史。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经我院医学伦理委员会审批，患者及家属均知情同意。

1.2方法

1.2.1血清lnc RNA Novlnc6水平的测定 使用TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)试剂盒根据制造商的方案分离总RNA。 使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)合成cDNA。 使用Hairpin-itTM qRT-PCR Primer Set(GenePharma Co.Ltd.，Shanghai，China)测定lnc RNA Novlnc6相对表达量，将U6 mRNA水平作为标准化为内源性参考。通过SYBR green qRT-PCR测定(Takara)测量lnc RNA Novlnc6。 各引物序列如下：lnc RNA Novlnc6正向，5′-ACACTCCAGCTGGGCTGAAGTGATGTGTAA-3′和反向，5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′; U6正向，5′-CCCCTGGATCTTATCAGGCTC-3′和反向，5′-GCCATCTCCCCGGACAAAG-3′。使用2-ΔΔCq方法确定表达量。qPCR循环条件为：一个循环为95℃，30 s；40个循环：95℃为15 s，60℃为30 s，72°C，持续30 s。所有实验均为重复三次以使其可靠。

1.2.2常规临床指标的测定 病例组(入院后6 h)及对照组(清晨空腹)肱静脉抽血；取静脉血10 mL置于无菌管中，室温静置30 min，3000 rpm离心,10 min，分离血清，贝克曼AU-480全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、肌酐(Crea)、尿酸(uric acid)。酶标仪测定hs-CRP。德国西门子 Acuson SequoiaC512 型彩色多普勒超声诊断仪检测患者左室射血分数 (LVEF)。

1.2.3随访 出院后每月定期电话随访，记录所有患者出院后的主要心脏不良事件(非致死性心肌梗死、死亡、血运重建等情况)

2 结 果

2.1对照组、冠心病组组别间各指标水平比较 与对照组比较，冠心病组Crea、TC、TG、LDL-C、FIB、Uric acid、hs-CRP水平升高，lnc RNA Novlnc6、HDL-C、LVEF水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 对照组、冠心病组组别间各指标水平比较

2.2稳定性冠心病组、急性冠脉综合征组组别间各指标水平比较 与稳定性冠心病组比较，急性冠脉综合征组Crea、TC、TG、LDL-C、FIB、Uric acid、hs-CRP水平升高，lnc RNA Novlnc6、HDL-C、LVEF水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 稳定性冠心病组、急性冠脉综合征组组别间各指标水平比较

2.3lnc RNA Novlnc6与各指标的相关性分析 lnc RNA Novlnc6与HDL-C、LVEF正相关关系明显，与Crea、TC、TG、LDL-C、FIB、Uric acid、hs-CRP负相关关系明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 lnc RNA Novlnc6与各指标的相关性分析

2.4lnc RNA Novlnc6表达水平与冠心病患预后分析 lnc RNA Novlnc6高表达组主要心脏不良事件、死亡、非致死性心肌梗死、血管重建、再狭窄、新发狭窄发生率低于lnc RNA Novlnc6低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 lnc RNA Novlnc6表达水平与冠心病患预后分析

2.5冠心病患者发生不良预后事件的多元Logistic回归分析 以冠心病患者发生不良预后事件(主要心脏不良事件、死亡、非致死性心肌梗死、血管重建、再狭窄、新发狭窄)为应变量(是=1，否=0)，单因素分析有意义的因素为自变量进行多因素Logistic逐步回归分析，结果发现高水平的Crea及低水平的lnc RNA Novlnc6、HDL-C均为冠心病患者发生不良预后事件的危险因素(OR=2.43、4.26、13.62，P<0.05)。见表5。

表5 冠心病患者发生不良预后事件的多元Logistic回归分析

3 讨 论

冠心病的治疗受到长期应用化学品期间产生的药物耐受性和高复发率的挑战。因此，迫切需要早期诊断和及时治疗以促进冠心病的治疗功效。可用于反映某些疾病的身体状况和高风险的生物标志物已广泛用于诊断各种人类疾病，包括冠心病。研究表明，血浆lncRNA coroMarker在冠心病诊断中的敏感性可达78.05%，特异性可高达91.89%，表明该lncRNA可能作为冠心病诊断的生物标志物。MicroRNA(miRNA)也是一组非编码RNA[10]。与lncRNA不同，miRNA的长度通常约为22 nt。研究发现miR-17/92a簇、miR-106b/25、miR-126 、miR-21/590-5p家族和miR-451都在冠心病的开发中具有重要作用；除了RNA之外，还发现TLR3和TLR4蛋白的表达水平与冠心病的严重程度密切相关；最近的一项研究表明，随着冠心病严重程度的增加，冠心病中血浆中亲环素A(CyPA)分泌的氧化应激水平增加，经适当处理后下降，因此CyPA的上调表达可作为冠心病诊断指标。然而，这些生物标志物的应用仍然受到个体检测差异的限制。因此，仍然需要更多的生物标志物。

众所周知，lncRNA参与心脏病的进展。随着全基因组关联研究的发展，发现多种lncRNA的表达与冠心病相关[11-13]。研究发现，6个单核苷酸多态性(SNP)与lncRNA心肌梗死相关转录本(MIAT)相关，与心肌梗死的发生率呈正相关。LncRNAs通过调节相关基因的表达参与心脏事件[14]。心脏功能在很大程度上取决于钾通道的正确活性，研究表明，作为钾通道编码基因的钾电压门控通道亚家族Q成员1(Kcnq1)的转录受lncRNA Kcnq1ot1表达的调控；INK4基因座中的lncRNA反义非编码RNA或人类染色体9p21上的CDKN2B-AS1(ANRIL)是第一个被证明能够促成冠心病易感性的lncRNA。 ANRIL可以募集胞质分裂蛋白1(PRC1)和PRC2的蛋白质调节因子来调节INK4b-ARF-INK4a簇中基因的表达，从而调节冠心病和不同类型癌症的进展[15-16]。 LncRNA Novlnc6是一种新鉴定的心脏特异性lncRNA，在心脏发育和心脏病发病机制中具有潜在功能。据报道Novlnc6能够调节Nkx2.5的表达，这是一种关键的心脏转录因子，而心肌细胞中Novlnc6的敲低可以显着抑制心脏发生。此外，在扩张型心肌病患者中，Novlnc6的表达总是被发现下调[17]。研究发现，Novlnc6可调节miR-21和PTEN的表达以抑制心脏纤维化，提示Novlnc6可能在心脏病中发挥保护作用；mTOR途径在冠心病的发展中起着不可或缺的作用，mTOR信号通路的激活可以启动冠心病患者的单核细胞促炎反应，促进这种疾病的进展。已经证明抑制该通路是改善冠心病的有效策略。研究发现，Novlnc6的下调显着增加了p-mTOR的水平，并且GAS5过表达显着降低了p-mTOR的水平，表明Novlnc6可以抑制mTOR的活化。本次研究结果显示，与对照组比较，冠心病组lnc RNA Novlnc6水平降低；与稳定性冠心病组比较，急性冠脉综合征组lnc RNA Novlnc6水平降低。这与上述讨论符合，说明冠心病患者循环lnc RNA Novlnc6水平降低。相关分析显示，lnc RNA Novlnc6与HDL-C、LVEF正相关关系明显，与Crea 、TC、TG、LDL-C、FIB、Uric acid、hs-CRP负相关关系明显。预后分析显示，lnc RNA Novlnc6高表达组主要心脏不良事件、死亡、非致死性心肌梗死、血管重建、再狭窄、新发狭窄发生率低于lnc RNA Novlnc6低表达组。这说明冠心病患者循环lnc RNA Novlnc6高表达者预后良好，说明冠心病患者循环lnc RNA Novlnc6水平降低。而多因素Logistic逐步回归分析发现高水平Crea及低水平lnc RNA Novlnc6、HDL-C为冠心病患者发生不良预后事件的危险因素。这提示Novlnc6低表达能促进冠心病进展，低水平的lnc RNA Novlnc6为冠心病患者发生急性冠状动脉综合征的危险因素。

综上所述，冠心病患者循环lnc RNA Novlnc6水平降低，Novlnc6低表达能促进冠心病进展；冠心病患者循环lnc RNA Novlnc6高表达者预后良好，低水平的lnc RNA Novlnc6为冠心病患者发生不良预后事件的危险因素。