不同浓度大黄水提取物对化疗大鼠营养水平及肠道黏膜屏障功能的影响※

梁玉龙 武治红 冯文静 刘向东

(河北医科大学第三医院普通外科，河北 石家庄 050051)

恶性肿瘤是危害人类生命健康的主要疾病，我国2014年新发恶性肿瘤病例约380.4万例，死亡病例229.6万例，严重影响我国公共卫生事业发展[1]。化疗为各种恶性肿瘤系统治疗的重要组成部分，能控制肿瘤进展，延长患者生存期，但化疗在有效杀死肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成损害，从而引起一系列不良反应，其中以胃肠道不良反应最常见，如恶心、呕吐、腹泻，严重者会出现黏膜坏死、脱落、便血及全身不良反应，被迫中止化疗而影响临床疗效[2-3]。如何预防并缓解化疗导致的胃肠道不良反应已成为肿瘤治疗的重要课题[4]。大黄是我国传统中药，对保护胃肠黏膜屏障、抑制细菌移位有积极作用[5-6]。近年来已有研究表明大黄对肠黏膜有良好的保护作用[7-8]。本实验观察不同浓度大黄水提取物对化疗大鼠营养水平及肠道黏膜屏障功能的影响，旨在为缓解肿瘤患者化疗期间的消化道的不良反应、减轻患者痛苦提供实验依据，结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选取100只Wistar大鼠，河北医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(2015-004)，体质量260～400 g，雌雄不限，28周龄。饲养在空调恒温室内，温度为(22±2)℃，相对湿度为50%～60%，避光。

1.1.2 实验仪器 层流净化台(苏州市苏信净化设备厂)；内毒素定量分析仪(BET-32B型，天津大学无线电厂)；低温冰箱(SANYO ULTRA LOW型；日本SANYO公司)；电动玻璃匀浆机(DY89-1型，宁波新芝生物科技股份有限公司)；低温离心机(Labofuge 400R型，德国Heraeus公司)；电热恒温培养箱(北京医疗器械厂)；涡旋混合器(北京金北德工贸有限公司)；多功能真彩色病理图像分析系统(CMIAS系列，北京航空航天大学图像中心)。

1.1.3 实验药物及试剂 大黄水提取物(大黄10倍水浸泡煎煮2次，合并2次滤液，浓缩至含生药0.4 g/mL，石家庄市中医院提供)，鲎试剂(湛江海洋生物制品厂，灵敏度：0.03 EU/mL)，氟尿嘧啶注射液(天津金耀药业有限公司，国药准字H12020959)，注射用奥沙利铂(南京制药厂有限公司，国药准字H20000686)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及造模 将100只Wistar大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组及大黄水提取物低、中、高剂量组5组，各20只。除空白组外，其余4组大鼠采用注射用奥沙利铂8 mg/kg+氟尿嘧啶注射液30 mg/kg(容积10 mL)，腹腔注射1次建立腹腔化疗模型。

1.2.2 给药 大黄水提取物低、中、高剂量组在建立化疗模型后分别予0.5、1.0、2.0 g/kg大黄水提取物，容积10 mL灌胃器灌胃给药，连续给药6 d。空白组、模型组常规饲养。

1.3 观察指标及方法 ①各组大鼠造模前后一般状态，包括造模前后精神状态、饮食、二便、被毛光泽等。②各组大鼠营养相关指标，包括体质量、摄食量、前白蛋白。每组大鼠造模前、给药后用电子天平测量所有大鼠体质量取平均值；每组大鼠造模前、给药后，前1日上午8时给每只大鼠放入300 g饲料，次日上午8时，用电子天平称量每只所剩饲料，据此计算大鼠摄食量；分别于造模前、给药后采取鼠尾动脉穿刺取血，每次取1 mL，按照酶联免疫吸附(ELISA)法测前白蛋白，试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司。③各组大鼠实验第7天血内毒素含量、回肠黏膜厚度值、结肠黏膜厚度值、肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率。血内毒素含量测定：实验第7天在无菌条件下将各组大鼠剖腹、剖胸，直视下心脏穿刺采血1.8 mL，注入含肝素0.2 mL(含25 U)无菌无热源瓶(常州优坦生物科技有限公司)中，取上清液，按步骤加入鲎试剂(按试剂说明书严格操作)，采用内毒素定量分析仪定量检测血内毒素含量。回肠黏膜厚度、结肠黏膜厚度观察：剖腹后距回盲部上下各3 cm取材，取回肠、结肠标本各3 cm，采用10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石腊包埋，组织块包埋时力求方向垂直，苏木素-伊红(HE)染色，切片，镜检，采用多功能真彩色病理图像分析系统测量回肠、结肠黏膜厚度，每张切片随机观察5个视野，取平均值。肠系膜淋巴结及肝组织细菌移位：打开腹腔，取出肠系膜淋巴结和肝组织各取200 mg，置于匀浆器内匀浆后分别取500 μL，于层流净化台内均匀涂布接种于琼脂平板，在37 ℃恒温培养箱内培养48 h后进行菌落计数，按照国际通用标准，>100菌落形成单位(CFU)/g肠系膜淋巴结(或肝组织)为细菌移位阳性。

2 结果

2.1 各组大鼠造模前后一般状态比较 造模前各组大鼠精神状态良好，活泼好动，饮食、二便正常，被毛光泽整齐。造模后空白组无明显变化；模型组活动减少，精神萎靡，出现大便稀溏、竖毛现象，易激惹；大黄水提取物低、中、高剂量组与模型组比较，一般状态尚好，除大便次数稍多外，未见其他异常。各组大鼠实验过程均存活。

2.2 各组大鼠造模前、给药后营养相关指标比较 见表1。

表1 各组大鼠造模前、给药后营养相关指标比较

由表1可见，造模前各组大鼠体质量、摄食量、前白蛋白比较差异均无统计学意义(P>0.05)；空白组造模前、给药后体质量、摄食量、前白蛋白比较差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组给药后体质量、摄食量、前白蛋白均较本组造模前降低(P<0.05)，且低于空白组(P<0.05)；给药后大黄水提取物低、中剂量组体质量均较本组造模前降低(P<0.05)，大黄水提取物低、中、高剂量组摄食量、前白蛋白均较本组造模前降低(P<0.05)；给药后大黄水提取物低剂量组体质量、摄食量、前白蛋白与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；给药后大黄水提取物中、高剂量组体质量、摄食量、前白蛋白均高于模型组(P<0.05)；给药后大黄水提取物高剂量组摄食量、前白蛋白高于大黄水提取物中剂量组(P<0.05)。

2.3 各组大鼠血内毒素含量、回肠黏膜厚度、结肠黏膜厚度比较 见表2。

表2 各组大鼠血内毒素含量、回肠黏膜厚度、结肠黏膜厚度比较

由表2可见，模型组血内毒素含量高于空白组(P<0.05)，回肠黏膜厚度、结肠黏膜厚度小于空白组(P<0.05)；大黄水提取物中、高剂量组血内毒素含量低于模型组(P<0.05)，回肠黏膜厚度、结肠黏膜厚度大于模型组(P<0.05)；大黄水提取物低剂量组血内毒素含量、回肠黏膜厚度、结肠黏膜厚度与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；大黄水提取物高剂量组血内毒素含量低于大黄水提取物中剂量组(P<0.05)，回肠黏膜厚度、结肠黏膜厚度大于大黄水提取物中剂量组(P<0.05)。

2.4 各组大鼠肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率比较 见表3。

表3 各组大鼠肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率比较 只(%)

由表3可见，肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率模型组高于空白组(P<0.05)；大黄水提取物中、高剂量组肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率均低于模型组(P<0.05)；大黄水提取物低剂量组肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率大黄水提取物低剂量组、中剂量组均高于大黄水提取物高剂量组(P<0.05)，大黄水提取物低剂量组高于中剂量组(P<0.05)。

3 讨论

注射用奥沙利铂+氟尿嘧啶注射液为临床常用化疗方案，目前广泛应用于结肠癌[9]、肝癌[10]、胃癌[11]等多种恶性肿瘤治疗中，具有良好的治疗效果。但注射用奥沙利铂+氟尿嘧啶注射液的大量应用导致肠黏膜屏障功能破坏，并导致严重的胃肠道反应，也是影响化疗顺利进行的重要因素[12-13]。本实验发现，模型组大鼠化疗6 d后，回肠黏膜厚度、结肠黏膜厚度均降低，体质量、摄食量、前白蛋白也明显降低，提示注射用奥沙利铂+氟尿嘧啶注射液化疗能明显降低大鼠营养水平，破坏肠道黏膜屏障功能。

现代医学认为，化疗药物可阻止胃肠黏膜上皮细胞DNA合成，导致胃肠黏膜上皮细胞代谢障碍及肠黏膜屏障功能的破坏，由此导致患者恶心、呕吐、腹泻，严重者会出现黏膜坏死、脱落、便血及全身不良反应，最终造成患者营养水平及肠道黏膜屏障功能降低[14-15]。中医学认为，化疗患者邪热壅滞，肠有燥屎，治以通降泻热为主，否则实滞不去，热势难清[16]。大黄为传统中药，具有泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经之效[17]。大黄苦寒泻热，荡涤肠胃积滞，对于邪热壅滞之证主要运用于两方面：其一为伤寒邪热传里，阳明结实，证见高热不退，腹胀满，腑气不通甚或神昏谵语，循衣摸床，苔黄厚或焦黑起刺，脉重按有力；其二为时病高热，热重发厥，即“热深厥深”之证，证见高热肢冷，排便困难，或热甚发狂、烦躁不安等[18]。运用大黄攻逐邪热，可使热退阴存而身安。本研究发现，大黄水提取物可有效减轻化疗对模型大鼠营养水平及肠道黏膜屏障功能的影响。现代药理学研究认为，大黄水提取物含大黄多糖、大黄素、大黄酸等多种活性成分，其中大黄多糖可明显促进机体免疫功能，对机体细胞多种损伤有保护作用，能使小鼠肠黏膜固有层中浆细胞明显增多，促进分泌型免疫球蛋白分泌，增强肠道局部免疫能力[19]；大黄素可抑制钠和钾离子从肠腔转运至细胞，使水分滞留在肠腔内，刺激大肠，促进其蠕动，从而起到泻下作用，同时能抑制癌细胞DNA、RNA和蛋白质的生物合成，抑制癌细胞的氧化脱氢[20]。有研究证实，大黄对氧自由基有明显清除功能，还能提高肠黏膜内酸碱度(pH值)，缓解胃肠道低氧状态，改善胃肠道功能[21]。因此，大黄水提取物可有效改善化疗模型大鼠胃肠道功能，从而减轻化疗药物对其营养水平及肠道黏膜屏障功能的影响。本研究结果发现，大黄水提取物低剂量组对化疗大鼠营养水平及肠道黏膜屏障功能的改善作用较小，而大黄水提取物中、高剂量组的改善作用非常显著，且与大黄水提取物剂量呈正相关。

此外，在化疗过程中，肠道结构和功能发生明显变化，引起肠黏膜屏障功能下降，可诱发肠道细菌和内毒素移位[22]。大量研究证实，肠黏膜直接或间接损伤所致的胃肠黏膜通透性增加是引起肠源性细菌、内毒素移位的主要原因[23-24]。本研究发现，模型大鼠化疗后血内毒素水平明显升高，回肠黏膜厚度和结肠黏膜厚度降低，存在较高的肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率，进一步证实化疗可对大鼠肠道结构和功能、肠黏膜屏障功能造成明显损伤。而大黄水提取物中、高剂量均可提高回肠、结肠黏膜厚度，降低血内毒素含量及肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率。由此可见，大黄水提取物在化疗期间对肠黏膜屏障功能及黏膜形态有明显的保护作用，降低血内毒素含量和减少细菌移位，有助于降低肠源性感染发生率。这与大黄能增强肠道免疫功能密切相关，可降低肠道局部氧自由基的产生，改善肠道微生态，保护肠黏膜屏障，降低血内毒素的产生，同时促进肠黏膜的修复和再生，缓解化疗引起的腹胀、腹痛、恶心呕吐等症状。

综上可见，大黄水提取物中、高剂量组可提高化疗模型大鼠回肠、结肠黏膜厚度，有效降低血内毒素含量及肠系膜淋巴结和肝组织细菌移位阳性率，减轻化疗引起的胃肠道不良反应，提高大鼠的营养水平。