一株拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵液对茶树幼苗的促生作用

周罗娜，陈银翠，周玉锋*，赵兴丽，卢声洁，刘 辉*，罗林丽，贺圣凌

1.贵州省农业科学院 生物技术研究所/贵州省农业生物重点实验室，贵州 贵阳 550006；2.贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 茶学院，贵州 贵阳 550025

木霉菌（Trichoderma spp.）可产生一系列对植物病原菌有拮抗作用的生物活性物质，提高农作物的抗逆性，有效控制植物病害发生[1-2]并促进植物生长。木霉菌的生物防控及促生作用已成为近年来研究的热点。李松鹏等[3]研究发现两株能够防治水稻纹枯病及促进水稻生长的哈茨木霉菌，陆淼等[4]研究发现了一株对甜瓜幼苗有促生作用及对甜瓜蔓枯病病原菌有抑制效果的木霉菌，马赛等[5]研究发现了一株对大白菜有促生作用及对根肿病有防治效果的哈茨木霉菌，赵玳琳等[6]研究了棘孢木霉GYSW-6 mL对草莓炭疽病的生防机制及其防病促生作用。在田间应用上，徐培培[7]等研究发现，在常规施肥的基础上，每667 m2添加哈茨木霉菌剂4 kg可减少水稻田20%的肥料用量，且水稻产量可比常规施肥增加，并减少水稻稻曲病、纹枯病的发生；卢德鹏等[8]通过田间试验检测得到木霉菌水分散粒剂（1×108cfu/g）对小麦纹枯病的防治效率可达71.59%，小麦增产率为16.8%；赵远征[9]等研究发现哈茨木霉可湿性粉剂、木霉菌·促生芽孢杆菌颗粒剂对马铃薯黑痣病均有防治效果和增产效果，且木霉菌·促生芽孢杆菌颗粒剂的防治效率最高可达76.33%，增产17.50%。以上研究均表明，木霉菌剂开发与使用能够有效减少作物化肥、农药的施用。本实验室前期分离得到了一株对茶炭疽病菌有较好拮抗作用的木霉菌[10-11]，但此菌株对茶树是否具有促生作用还未明确。

本研究通过盆栽试验，测定木霉菌发酵液对茶树幼苗生长指标（株高、根长、根重）、叶绿素总量、MDA摩尔质量浓度和酶活性（PPO、POD、PAL）的影响，以明确该木霉菌发酵液对茶树幼苗的促生作用。以期为木霉菌新型生物制剂的开发利用与茶产业的绿色发展奠定基础，达到茶园“双减”效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

木霉菌（Trichoderma asperelloides）：由本实验室分离保存，对茶炭疽病菌有拮抗作用。

1.1.2 种子

福鼎大白茶茶树种子，采自贵州省农科院茶园。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1000 mL。

PDB培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水 1000 mL。

发酵培养基：马铃薯200 g、葡萄糖18.34 g、酵母浸膏1.88 g、磷酸氢二钾0.86 g、硫酸亚铁0.63 g、蒸馏水 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌发酵液的制备

平板活化：在PDA培养基上接种直径5 mm木霉菌菌饼，28℃ 恒温培养，培养7 d。

种子液培养：在500 mL锥形瓶中装 100 mL PDB培养基，从平板上挑取菌落接种于摇瓶中，培养温度 28℃，摇床转速120 r/min，培养 3 d后进行接种发酵。

发酵培养：在 500 mL 锥形瓶中装 100 mL发酵培养基，向培养基中接种1%的种子液，培养温度 28℃，摇床转速 120 r/min，培养 7 d。

发酵液制备：发酵完成后，将发酵液经抽滤去除菌丝后即得试验用发酵液。

1.2.2 木霉菌发酵液对茶树幼苗的促生试验

茶树种子消毒：选取大小均一、颗粒饱满的福鼎大白茶茶树种子，放入3%次氯酸钠中浸泡1 min进行表面消毒，消毒完成后用清水将茶种表面清洗干净。

茶树种子催芽：使用40℃～ 60℃温水将表面消毒完成的茶树种子浸泡48 h（每8 h换一次水）。浸泡完成后，将茶树种子放入湿润的蛭石中，25℃条件下进行催芽。

茶苗灌根处理：待茶苗长出约1 cm时，将长势相近的茶苗移栽到盛有营养土的育苗盘中，进行灌根处理。将发酵液制备成原液、稀释50倍、稀释150倍等3种浓度，用注射器分别吸取制备好的发酵液 20 mL，在移栽后的 0 d、5 d、10 d、15 d注入土中，同时注入等量的水作为对照（CK）。

在灌根处理后的20 d，分别测量株高、根长、根重。并测定叶绿素总量、过氧化物酶、多酚氧化酶、丙二醛浓度、苯丙氨酸降解酶的活性。每组实验设3个重复。

1.2.3 物质含量和酶活性的测定

物质含量和酶活性测定方法：叶绿素总量采用乙醇提取-比色法[12]、丙二醛MDA采用硫代巴比妥酸法、多酚氧化酶PPO采用邻苯二酚法、苯丙氨酸解氨酶PAL采用苯丙氨酸比色法、过氧化物酶POD采用愈创木酚法。过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、丙二醛的测定均使用上海索桥生物科技有限公司的试剂盒。

2 结果与分析

2.1 对茶树幼苗生长指标的影响

2.1.1 根长与根重

由表1可知，不同浓度的发酵液对茶树幼苗进行灌根处理20 d后，根长、根重差异较明显。其中，木霉菌发酵原液对茶树幼苗的根长、根重具有抑制作用；木霉菌发酵液稀释50倍液和稀释150倍后，对茶树幼苗的根长、根重均有促进作用（图1）；当木霉菌发酵液稀释50倍时促生作用最为明显，相比CK，根长增加40.4%，根重增加 61.70%（P< 0.05）。

表1 不同浓度木霉菌发酵液处理后的 茶树幼苗根长与根重Table 1 Root length and root weight of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.1.2 株高

由表2可知，木霉菌发酵原液、稀释150倍液处理后的茶树幼苗的株高，相对CK差异不显著。木霉菌发酵原液对株高稍有抑制作用，稀释150倍液稍有促进作用，稀释50倍液的株高明显高于CK（图1），增加量达12.57%。

表2 不同浓度木霉菌发酵液处理后的茶树幼苗株高Table 2 Plant height of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

图1 不同浓度木霉菌发酵液处理后的茶树幼苗生长情况Figure 1 Growth of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2 对茶树幼苗物质含量和酶活性的影响

2.2.1 叶绿素总量

由表3可知，不同浓度木霉菌发酵液处理茶树幼苗20 d后，对茶树叶片的叶绿素总量影响不同。稀释50倍的木霉菌发酵液条件下茶树幼苗的叶绿素总量比对照增加14.71%，原液和稀释150倍液均使茶树幼苗的叶绿素总量减少。

表3 不同浓度木霉菌发酵液处理后的 茶树幼苗叶绿素总量Table 3 Total chlorophyll content of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.2 丙二醛（MDA）摩尔质量浓度

由图2可知，用不同浓度木霉菌发酵液处理茶树幼苗20 d后，MDA摩尔质量浓度较CK均有所下降，下降幅度为1.77%～27.93%。当木霉菌发酵液稀释50倍时，MDA摩尔质量浓度下降最为明显，较对照降低了27.93%（P< 0.05）。

图2 不同浓度木霉菌发酵液处理后的茶树幼苗MDA摩尔质量浓度Figure 2 MDA molar mass concentration of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性

由图3可知，木霉菌发酵原液和稀释150倍液均使茶树幼苗的PPO酶活性显著降低， 稀释50倍液使茶树幼苗的PPO酶活性显著增高，较对照 CK 增加 31.47%（P< 0.05）。

图3 不同浓度木霉菌发酵液处理后的茶树幼苗PPO活性Figure 3 PPO activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

由图4可知，木霉菌发酵原液和稀释150倍液均使茶树幼苗的PAL酶活性降低，但不显著；稀释50倍液使茶树幼苗的PAL酶活性显著增高，较对照增加 10.64%（P< 0.05）。

图4 不同浓度木霉菌发酵液处理后的茶树幼苗PAL活性Figure 4 PAL activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.5 过氧化物酶（POD）活性

由图5可知，木霉菌发酵原液和稀释150倍液均使茶树幼苗的POD酶活性降低，稀释50倍液使茶树幼苗的POD酶活性增高，比对照CK增加4.21%，增加幅度不显著。

图5 不同浓度木霉菌发酵液处理后的茶树幼苗POD活性Figure 5 POD activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

3 结论与讨论

本试验以对茶树炭疽病菌有拮抗作用的一株木霉菌为试验菌株，通过盆栽试验测定其发酵液对茶树幼苗的促生作用。结果表明，使用稀释50倍的木霉菌发酵液对茶树幼苗进行灌根处理20 d后，茶树幼苗的株高、根长和根重增长明显，增幅分别达12.57%、40.40%和61.70%。

通过测定茶树幼苗叶片叶绿素总量、MDA摩尔质量浓度以及PPO、POD、PAL酶活性，可以得出，经稀释50倍的木霉菌发酵液灌根处理20 d后的茶树幼苗，叶绿素总量明显增加，增幅为 14.71%（P < 0.05）；MDA 摩尔质量浓度明显降低，降幅为 27.93%（P < 0.05）；PPO、POD、PAL酶活性增高，增幅分别为31.47%（P < 0.05）、10.64%（P < 0.05）和 4.21%。

叶绿素是影响植物光合作用过程的重要色素，叶绿素含量的多少直接影响植物体光合作用的强弱和植物体有机物的合成与积累[13]。在本试验中，稀释50倍的木霉菌发酵液处理过的茶树幼苗叶绿素总量与对照比较明显增加，有利于茶树幼苗物质的量的积累，可为后期提升茶叶产量奠定基础。

PPO作为植物体内重要的氧化酶，可将多酚物质直接氧化为醌类物质形成保护性屏蔽使植物细胞免受病菌的侵害，发挥抗病作用；同时醌类化合物参与合成木质素，促进细胞壁的木质化，抵抗病原菌的侵染。木质素是植物抵抗病原菌侵入和扩散的重要防卫手段，POD催化脂肪族、芳香族和酚类的氧化，是木质素合成的关键酶之一[14]，POD酶活性与植物的抗病性密切相关。PAL作为苯丙烷类代谢途径的关键酶，在植物生长发育、防紫外线辐射、抵御病虫害方面起着重要的作用。PAL活性与植物抗病性呈正相关，可作为衡量植物抗逆性强弱的指标[15-16]。本试验中，PPO、POD、PAL酶活性均有所增加，结果说明稀释50倍的木霉菌发酵液可提高茶树幼苗的抗病性。其中茶树PPO酶活性的增加，可增加茶叶的风味，提高茶叶品质[17-18]。

MDA作为细胞脂质过氧化的最主要终产物，可以反应植物细胞中膜脂过氧化程度，MDA浓度与膜脂过氧化程度呈正相关，MDA浓度越高，说明细胞中膜脂过氧化程度越高，细胞膜损害越严重。本试验中，经稀释50倍的木霉菌发酵液灌根处理20 d后的茶树幼苗MDA浓度明显降低。此结果说明稀释50倍的木霉菌发酵液明显降低了茶树幼苗的细胞膜过氧化程度，增加了茶树幼苗对生长环境的抗逆性，此结果与PPO、POD、PAL酶活性结果相一致。

以上结果是通过室内盆栽试验证明的，田间应用效果还有待进一步研究。