小麦盐胁迫持续上调转录因子基因TaERF8-2D的克隆及其分析

崔德周，李永波，隋新霞，黄琛，杨在东，樊庆琦，楚秀生，3

（1.山东省农业科学院作物研究所／农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室／小麦玉米国家工程实验室，山东 济南 250100；2.山东鲁研农业良种有限公司，山东 济南 250100；3.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014）

盐胁迫是制约农业发展的全球性问题。据统计，全球约8.3亿公顷的耕地遭受着土壤盐渍化的侵蚀［1］。我国盐碱地总面积约为3 600万公顷，盐胁迫每年造成的粮食减产达总产的15%以上［2］。小麦是我国主要粮食作物之一，也是盐渍化土壤重要的栽培作物，其耐盐性的高低直接决定是否能够稳产、高产。因此克隆小麦耐盐基因，解析其对盐胁迫的响应机制，对小麦耐盐遗传改良具有重要意义。

转录因子是生物体内一类重要的调节蛋白，它们通过与启动子区域的顺式作用元件发生特异性结合，直接调控下游靶基因的表达［3］。AP2／EREBP（APETALA 2／ethylene-responsive element binding protein）类转录因子是植物中特有的一类转录因子，因含有AP2／EREBP结构域而得名。在拟南芥中，Sakuma［4］和张麒［5］等根据其序列相似性和AP2／EREBP结构域的数量，将其分为AP2（APETALA 2）、RAV（related to ABI3／VP1）和EREBP（ethylene-responsive element binding protein）三大类型。EREBP型转录因子根据其在DNA结合区第14位和第19位的氨基酸序列差异，又可分为DREB（dehydration-responsive element binding protein）亚族和ERF（ethylene-responsive factor）亚族，其中DREB亚族第14位和第19位分别是缬氨酸和谷氨酸，而ERF亚族则是丙氨酸和天冬氨酸［4］。随着基因组学和高通量测序技术的发展，拟南芥、水稻、黄瓜、苜蓿等多种植物中ERF亚族的系统鉴定与分析被陆续报道［6-9］。

ERF类转录因子在植物生长发育、信号转导及逆境响应中发挥重要作用［5，10，11］。拟南芥ERF109通过介导茉莉酸信号转导和生长素合成通路间的交互作用，调控侧根的发生［12］。过表达苹果ERF3基因可促进花青苷和原花青苷的积累［13］。大豆ERF3基因可被高盐、干旱等诱导表达，将其在烟草中过表达后，可显著提高烟草对高盐和干旱胁迫的耐受能力［14］。普通小麦中ERF类转录因子成员有47个［15］，主要参与应答生物或非生物逆境胁迫，然而，目前仅有少数几个ERF基因被克隆，并进行相应的研究。研究表明，小麦ERF1基因的表达受高盐、干旱、低温、ABA、乙烯、水杨酸以及白粉病菌侵入的诱导［16］；Zhu等克隆了受病原菌诱导的TaPIE1（pathogeninduced ERF1）基因，发现该基因的表达受纹枯病菌和低温胁迫共同诱导［17］；TaERF3基因除应答高盐和干旱胁迫外，对病原菌侵入和外源激素处理也有响应［18，19］；TaERF4基因在拟南芥中通过抑制液泡膜NHX活性，负调控耐盐性［20］；TaERF8-2B在调控普通小麦株高、抽穗期和千粒重中发挥重要作用［21］，而TaERF8-2A和TaERF8-2D基因虽已被克隆，但尚未对其功能进行解析，更未有在耐盐小麦品种中进行基因功能分析的报道。

本研究利用本团队获得的耐盐小麦转录组数据，从耐盐小麦品种德抗961中克隆了盐胁迫下持续上调的基因TaERF8-2D，并对其进行了生物信息学分析、亚细胞定位和盐胁迫下的基因表达分析，以期为深入研究该基因在小麦盐胁迫中的耐盐功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用耐盐小麦品种为德抗961，由山东省农业科学院作物研究所小麦种质创新与利用团队保存。

1.2 TaERF8-2D基因克隆及生物信息学分析

利用本团队获得的耐盐小麦品种德抗961的转录组EST数据，通过Ensembl小麦基因组数据库进行比对，使用Primer Premier 5.0软件设计获得特异引物（F：5′-ATGGTCTCCGCTCTGTCC-3′；R：5′-TCACGAGTCTTTATTATTTTTGTGC-3′），以德抗961幼苗叶片cDNA为模板，扩增TaERF8-2D基因的CDS序列。PCR扩增程序：95℃5 min；95℃30 s，50℃30 s，72℃45 s，35个循环；72℃10 min；16℃，保存。胶回收后的DNA，连接到pEASY-Blunt Cloning Kit（全式金，北京），并转化大肠杆菌Trans5α（全式金，北京）。挑选阳性克隆，送北京擎科新业生物技术有限公司（青岛）进行测序。

利用ExPASy-ProtParam（http://www.expasy.org／tools／protparam.html）和ProtScale（https://web.expasy.org／protscale／）分别分析TaERF8-2D蛋白的理化性质和亲疏水性。使用SignalP 5.0在线工具（http://www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）进行信号肽预测。采用TMHMM 2.0在线软件 （http://www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM-2.0／）预测TaERF8-2D蛋白的跨膜结构。通过NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）在线预测分析蛋白的磷酸化位点。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa＿automat.pl？page＝npsa＿sopma.html）对编码蛋白的二级结构进行预测。

1.3 亚细胞定位分析

设计带有XbaⅠ和SalⅠ酶切位点的特异性引物 （F：5′-GCTCTAGAATGGTCTCCGCTCTGTCC-3′；R：5′-ACGCGTCGACCGAGTCTTTATTATTTTTGTGC-3′），扩增无终止密码子的TaERF8-2D全长CDS片段，经双酶切后，连接到表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP，并转化大肠杆菌Trans5α，然后筛选阳性克隆。将重组质粒转化农杆菌GV3101，鉴定阳性克隆并保存。将重组质粒和对照空载体分别转化拟南芥原生质体，室温培养过夜，在激光共聚焦显微镜下，观察原生质体中绿色荧光的分布情况。

1.4 盐胁迫下的基因表达分析

将室温22℃、光照培养10 d的德抗961小麦幼苗置于250 mmol／L NaCl溶液中进行胁迫处理，分别在处理0、3、6、12、24 h和48 h时取第一片展开叶片，液氮速冻后，于-80℃保存备用。

按照植物组织RNA快速提取试剂盒（天根生化，北京）提取小麦叶片总RNA。采用反转录试剂盒（全式金，北京）合成cDNA第一链。利用TaERF8-2D基因的特异引物［21］（F：5′-CGACAGATTGCAGCAACAACAACAGTG-3′；R：5′-CCCGTTGTGCCTGAGCTCGATATA-3′）和Tubulin内参引物（F：5′-TCGATGA TCTCCAACTCCACCAGT-3′；R：5′-TCGTCGAACTCAGCACCAACTTCT-3′）进行RT-PCR。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。

2 结果与分析

2.1 小麦TaERF8-2D基因的克隆

以耐盐小麦德抗961的cDNA为模板，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，在750 bp左右出现一个特异DNA条带（图1）。通过对其回收和测序，发现该片段长度为762 bp，编码253个氨基酸。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 TaERF8-2D编码蛋白的二级结构分析利用SOPMA网站对该基因编码蛋白的二级结构进行分析，结果表明，该编码蛋白二级结构中无规则卷曲比例最高，占68.39%，α-螺旋占19.76%，延伸链占8.30%，β-转角占3.56%（图2）。

2.2.2 蛋白理化性质分析 通过ExPASy-Prot-Param分 析，TaERF8-2D蛋 白 的 分 子 式 为C1176H1845N353O365S6，分子量为26.96 kD，理论等电点（pI）为9.55，不稳定系数为57.39，推测该蛋白为不稳定蛋白。对该蛋白的亲水性、疏水性进行分析表明，其总平均吸水性为-0.521，属于亲水蛋白（图3）。

2.2.3 蛋白信号肽预测 利用SignalP 5.0和TMHMM 2.0在线预测表明，该蛋白既无信号肽，也不存在跨膜结构域（图4），由此推断该蛋白不是分泌蛋白。

图2 TaERF8-2D蛋白的二级结构

图3 TaERF8-2D蛋白的亲水性和疏水性预测

图4 TaERF8-2D信号肽（A）及跨膜结构域（B）分析

2.2.4 氨基酸磷酸化修饰位点分析 使用在线软件NetPhos 3.1对TaERF8-2D蛋白的磷酸化位点进行分析，结果表明，该蛋白共有30个氨基酸磷酸化位点，其中丝氨酸（Ser）磷酸化位点最多，有16个；其次为苏氨酸（Thr），磷酸化位点有13个；而酪氨酸（Tyr）磷酸化位点仅有1个（图5）。

图5 TaERF8-2D蛋白的氨基酸磷酸化位点分析

2.3 亚细胞定位

将含有重组载体pCAMBIA2300-35S：：TaERF8-2D-GFP和对照空载体pCAMBIA2300-35SGFP的菌液，利用瞬时转染法导入拟南芥原生质体，25℃暗培养24 h后，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白信号。结果显示，TaERF8-2D：：GFP融合蛋白仅在细胞核有明显的绿色荧光，而对照空载体在细胞膜、细胞核和细胞质中都可以观察到绿色荧光信号，由此表明，编码的TaERF8-2D蛋白定位于细胞核（图6）。这与报道的ERF类转录因子主要定位于细胞核的结论相一致［22，23］，主要参与细胞核内转录调控过程。

图6 TaERF8-2D蛋白的亚细胞定位

2.4 盐胁迫下TaERF8-2D基因的表达分析

利用RT-PCR检测TaERF8-2D基因对盐胁迫的响应特性。结果显示，在盐胁迫24 h和48 h时，该基因的表达显著增强（图7），进一步证明TaERF8-2D基因可能与小麦盐胁迫的响应密切相关。

图7 TaERF8-2D基因响应盐胁迫的RT-PCR分析

3 讨论与结论

ERF类转录因子是植物中特有的一类转录因子，广泛参与植物发育、代谢和抗逆过程［5，10-14］，是改良植物遗传特性的优异基因资源。ERF类转录因子主要参与逆境胁迫响应和生长发育，在众多的ERF类转录因子成员中，仅有少数几个ERF基因从普通小麦中被克隆出来［16，18-21，24］。本研究利用本团队获得的耐盐小麦转录组及其基因表达数据，从耐盐小麦品种中筛选到对盐胁迫响应非常明显的基因TaERF8-2D。而有关TaERF8-2D基因编码的蛋白信息以及该基因对小麦盐胁迫的响应尚未见报道，因此明确该基因编码蛋白质的特性、亚细胞定位以及盐胁迫下的基因表达模式，对于进一步探究该基因的耐盐功能具有重要意义。

蛋白质的理化特性、亚细胞定位与其生物学功能密切相关。本研究结果表明，小麦TaERF8-2D基因编码的蛋白质属于亲水蛋白，没有信号肽且不存在跨膜结构域，不属于分泌蛋白，该蛋白定位于细胞核，这与大多数转录因子的定位信息相一致［22］。蛋白质磷酸化作为一种重要的翻译后修饰，是调控蛋白质活力和功能的重要机制，广泛参与细胞信号转导、抗逆胁迫等多种生物过程［25］。本研究表明，TaERF8-2D蛋白共有30个氨基酸磷酸化位点，推测TaERF8-2D基因可能经过蛋白磷酸化修饰后，行使其响应盐胁迫等逆境胁迫的生物学功能。

前人研究表明，ERF类转录因子在响应植物盐胁迫方面扮演重要角色。本研究RT-PCR结果表明，盐胁迫处理后，TaERF8-2D表达被显著诱导，这与OsERF103、GmERF3、TaERF1、TaERF3等ERF类转录因子表达趋势相似［14，16，19，26］，暗示TaERF8-2D基因在小麦盐胁迫响应过程中可能发挥重要作用，但其具体调控机制仍有待于进一步研究。