原发性肝癌患者外周血单个核细胞线粒体DNA含量检测及其临床意义

廖新爱 冯惠娟 卓传尚 叶治 柳丽娟

在肝癌早期及预后诊断中缺乏灵敏度和特异度高的诊断标志物[1]，因此评估肝癌风险亟需新的替代或联合检测标志物。

线粒体含有独立于核基因组的DNA，称为线粒体DNA(mtDNA)。由于mtDNA没有组蛋白，缺乏抗氧化机制以及有效的修复系统，因此各种刺激因子的作用容易引起mtDNA产生突变或含量变化，并与癌症的发生及发展密切相关[2]。目前，mtDNA含量相关研究主要集中在癌组织以及外周血单核细胞(peripherali blood mono-nuclear cell,PBMC)，PBMC mtDNA在一定程度上可以反映组织中mtDNA含量的变化，可用来监测线粒体的损伤以及疾病的发展情况。已有研究发现，PBMC mtDNA含量变化与糖尿病、尿毒症、脓毒血症以及多种肿瘤发生及病死率相关，可作为潜在的生物标志物[3-5]。本研究通过实时荧光定量PCR检测PLC患者及健康人群PBMC中mtDNA变化趋势，探讨PBMC mtDNA在肝癌诊断中的临床意义。

资料与方法

一、研究对象

收集2018年9月至2019年11月在福建医科大学孟超肝胆医院住院治疗的PLC患者250例，同期收集健康献血者48名为健康对照。PLC患者的诊断标准参照《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》。收集所有研究对象临床信息及实验室指标[总胆红素(TBil)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及乙型肝炎e抗原(HBeAg)等]。本研究通过福建医科大学孟超肝胆医院伦理委员会批准并获得研究对象知情同意。

二、检测方法及仪器

AU5800全自动生化仪检测血清TBil、ALT、AST等生化指标(美国贝克曼库尔特公司)；ARCHITECT i2000Sr全自动免疫分析仪检测HBV标志物(美国雅培有限公司)；G1200检测AFP(日本富士科技有限公司)。

三、PBMC mtDNA提取及含量测定

取EDTA-K2抗凝血5 mL，采用人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll 1.077 g/mL购自GIBCO公司)提取PBMC，基因组DNA(包括mtDNA)的提取参照DNA提取试剂盒说明书(购自中国北京全式金生物技术有限公司)。通过NADH脱氢酶亚基 1(ND1)来确定mtDNA的含量，选用β-globin作为内参基因，ND1以及β-globin引物序列参见文献[6]，引物序列见表1(引物序列由中国福州尚亚生物技术有限公司合成)。实时荧光定量PCR反应体系为25 μL：SYRB的PCR混合液12.5 μL，50×ROX II 0.25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，灭菌ddH2O 10.25-VDNA μL，模板DNA 20 ng。扩增条件为：95℃ 20 s预变性，95℃ 3 s，58℃ 30 s 进行30个循环。线粒体DNA相对含量表示为2-[Ct(ND1)-Ct(β-globin)]，其中Ct代表标本扩增曲线中循环阈值。

表1 PCR引物序列及片段长度

四、统计学分析

结 果

一、临床特征

250例PLC患者中，HBsAg阳性233例(93.20%)，HBeAg阳性39例(16.74%)，HBeAg阴性194例(83.26%)。210例(84.00%)有肝硬化背景。PLC患者的男性占比、年龄、血清胆红素、总蛋白、白蛋白、血清酶学、AFP相对含量均高于健康人群。见表2。

表2 PLC患者及健康人群临床特征比较

二、实时荧光定量PCR扩增结果

PBMC提取的DNA与相对应的引物进行实时荧光定量PCR，结果显示，所有标本mtDNA与核DNA PCR扩增曲线均呈现S形，表明所有样品的目的产物呈指数扩增，即扩增效率为100%，扩增反应良好，阴性对照无扩增，检测结果可靠。

三、PLC患者和健康人群PBMC mtDNA 相对含量的比较

分析PLC患者和健康人群PBMC mtDNA ND1基因的相对含量，结果显示：PLC患者PBMC mtDNA相对含量为90.51 (49.78,165.44)，显著低于健康人群的456.67(2446.47，1017.60)，差异有统计学意义(W=32579.00，P<0.01)。

四、PLC患者中mtDNA与性别、年龄、HBsAg、肝硬化背景及AFP的相关分析

由于PBMC mtDNA为非正态分布连续性资料，采用Spearman进行相关分析，结果显示，PLC患者中PBMC mtDNA与性别、年龄、HBsAg、肝硬化背景及AFP的P值分别为：0.671、0.284、0.184、0.397、0.832，差异无统计学意义。提示PBMC mtDNA与患者的性别、年龄、HBsAg、肝硬化背景及AFP均无相关性。

五、PBMC mtDNA诊断效能评估

ROC曲线分析结果显示，mtDNA诊断PLC的AUC为0.884，高于AFP的0.863，但差异无统计学意义(Z=0.493，P=0.622)。mtDNA诊断PLC的最佳cut-off值为F≤164.28，灵敏度为75.20%，略高于AFP的71.70%。mtDNA与AFP二者联合诊断可以显著提高诊断性能，AUC达0.957，高于mtDNA或AFP单独检测时的效能(z值分别为3.485和1.25，均P<0.01)，灵敏度提高到84.91%，而特异度虽稍降但仍高达93.18%，见表3。

表3 mtDNA、AFP及二者联合检测诊断PLC的性能

讨 论

研究发现，肝癌患者PBMC mtDNA含量显著降低，提示mtDNA可能是潜在的肝癌标志物[6-8]。本研究结果显示PLC患者PBMC mtDNA相对含量低于对照组，与文献报道一致。ROC曲线分析结果显示，虽然AFP有较高的AUC和特异度，但是灵敏度只有71.7%，相比较而言，mtDNA用于诊断PLC时，具有较高的AUC(0.884)和灵敏度(75.20%)。相关性分析显示，mtDNA与AFP不相关，可以互补，二者联合检测可大大提高对PLC的诊断性能，AUC提高到0.957，灵敏度达到84.91%，而特异度略微降低，仍高达93.18%。

mtDNA作为独立于细胞核染色体外的基因组，受到损伤后其基因发生突变或水平出现变化[9]。最近研究发现，mtDNA含量的增加与罹患非霍奇金淋巴瘤、肺癌、结直肠癌、乳腺癌具有相关性，mtDNA含量减少则可增加罹患软组织肉瘤的风险[10-13]。氧化应激可引起mtDNA含量变化，mtDNA D-环区对氧化应激敏感，易发生基因突变等损伤，进而导致mtDNA含量下降或改变，白细胞的mtDNA含量受血液循环中血浆抗氧化剂/氧化剂以及DNA氧化损伤所引起的氧化应激的影响[14-16]。另外，细胞自噬也参与mtDNA含量的调控，高水平的活性氧(ROS)引起mtDNA损伤，间接引起mtDNA含量的下降[17]。PLC患者PBMC的mtDNA含量降低可能通过改变细胞能量代谢及机体抗氧化水平进而影响肿瘤免疫。但是，关于肝癌患者的PBMC mtDNA含量下降的具体调控机制目前尚不清楚，有待下一步深入研究。

本研究为单中心的横断面研究，可能存在样本、疾病谱偏差，且缺少相应的肝炎和肝硬化患者的队列作为相应的对照等，后续需要进一步扩大样本及进行多中心研究加以验证。总之，本研究的结果证实了PLC患者PBMC mtDNA含量较健康人群显著下降，具有较高的临床诊断价值，有望成为新的肝癌血清标志物以帮助临床医师在临床实践过程中对PLC做出诊断。