基于网络药理学和分子对接探讨自拟排石汤治疗泌尿系结石的作用机制研究

赵子龙，杨 夏，高柏青＊

（内蒙古包钢医院药学部，内蒙古 包头 014010）

泌尿系结石是泌尿外科最外常见的疾病之一，其发病原因与生活环境和饮食习惯密切相关，发病机制并未明确且研究数量不多，患者出现症状可见绞痛和放射性疼痛，如何做好泌尿系结石的防治工作已成为医疗界和全社会关注的问题[1]。泌尿系统结石在中医领域属“淋证”范畴[2]。外感湿热或秽浊之邪，或者嗜食肥甘厚腻，或者嗜酒，均能够导致湿热内生，蕴积于内湿热流注下焦，则尿液倍受热灼煎熬，久而久之则诱发石淋之病。或者热灼伤血络，迫血妄行导致血液外溢，继而发生血淋。根据此病的发病机理，治疗结石的药物应该具有以下三个要素：一为利尿通淋，促进尿液排出量的增加，促使体内产生自排压力。二为清热泻火，尽早治疗泌尿系炎症，减轻炎症导致的水肿及感染。三为行气活血，解除输尿管平滑肌和括约肌痉挛。三要素结合，能够促使结石顺利排出体内。

将传统中医辨证施治理论作为基础，针对泌尿系结石的病因病机，本院自制协定处方—排石汤，其组方按君，臣，佐，使的配伍原则，依据治疗结石三要素精选药物进行配制而成。我院自拟的排石汤用于治疗泌尿系结石具有较好的疗效，方中由金钱草、海金砂、王不留行、益母草、郁金、车前子、丹参、怀膝、生甘草9味药材组成。君药金钱草味苦，酸，微寒。归肝，胆，肾，膀胱经，功能清热解毒，利尿排石，活血散淤。臣药海金砂性下降，善清小肠、膀胱湿热，功专利尿通淋止痛，尤善止尿道疼痛，为治诸淋涩痛之要药。臣药王不留行具有利尿通淋功效，益母草具有利尿消肿，清热解毒之功效[3]。此外，佐药郁金、车前子、丹参、怀膝、生甘草等几味药材也都具有不同程度的利尿作用[4，5]。网络药理学研究策略广泛应用于中医药的相关研究，其整合生物电子信息数据库数据对中药复杂成分的作用靶点和代谢途径进行分析和预测，利用网络药理学方法在一定程度上可以节约时间、降低新药研发成本并提高成功率。本研究采用网络药理学和分子对接方法探索排石汤治疗泌尿系结石的作用机制，为后续的新药开发及其机制验证提供理论支撑。

1 方法

1.1 排石汤的化学成分和作用靶点的检索

使用中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN）（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）检索排石汤的9味组成药材（金钱草、海金砂、王不留行、益母草、郁金、车前子、丹参、怀膝、生甘草）的成分和作用靶点，筛选Score cutoff>39且P<0.05的活性成分并进行调控靶点的整理。

1.2 泌尿系结石疾病靶点的检索

以“Urolithiasis”为关键词在Genecards（https：//www.genecards.org/）及DisGeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）数据库搜索泌尿系结石的相关靶点。

1.3 筛选交集靶点和核心靶点

将排石汤的活性成分作用靶点与泌尿系结石疾病相关靶点进行交集靶点的可视化分析，并将靶点数据上传至String数据库（https：//strin g-db.org/）中构建PPI（protein-protein interaction）网络。利用Cytoscape软件（http：//www.cytoscape.org/）计算PPI相关网络参数，以网络中节点间隔度和自由度等参数大于均值为条件筛选核心靶点[6]。

1.4 GO和KEGG功能富集分析

将核心靶点上传至String数据库进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的富集分析，物种设定为人，基因名称为官方名称（official gene symbol），显著性P<0.05，最后对分析结果进行可视化。

1.5 分子对接

为进一步验证活性成分与蛋白靶点之间的结合活性，应用Autodock对“成分-靶点”作用网络中自由度显著的成分进行相关靶点的分子动力学模拟，Pymol可视化化合物与对应靶点蛋白的结合模式。在PDB（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中检索蛋白靶点并获得.pdb文件，应用ChemDraw构建小分子.mol结构文件。对小分子和蛋白进删除配体分子和水分子、不完整残基、多余蛋白质构象，并加氢和分配相关电荷等操作后进行半柔性对接分析。结合能小于0kcal/mol表示可以自由结合[6]。

2 结果

2.1 排石汤活性化合物和靶点的整理

共检索符合条件的活性成分124个，包括来自车前子的黄芩苷，来自丹参的丹参酮，来自甘草的甘草次酸等活性成分。对所有活性成分和作用靶点构建“药材-成分-靶点”作用网络（见图1），黄色节点代表药材，粉色节点代表活性成分，青色节点代表活性成分作用的靶点。

图1 药材-成分-靶点作用网络

2.2 筛选交集靶点和核心靶点

整合Genecards、DisGeNET数据库搜集的泌尿系结石相关靶点，筛选泌尿系结石与复方的共有靶点140个。将共有靶点上传至String进行PPI分析，组织（Organism）设置为“Homo sapiens”。共有140个节点，998条边，平均节点度值为14.3，预期的边数：313，PPI富集p-value<1.0e-16，网络节点代表着各个靶点，线条代表着靶点之间的联系（见图2）。

图2 交集靶点的蛋白互作网络

利用cytoscape计算String中PPI的网络参数，以“间隔度”“自由度”值大于均值（175.18，14.57）为条件筛选出27个核心靶点，包括肿瘤坏死因子（TNF），前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2），血管紧张素转化酶（ACE），立早基因（JUN），白细胞介素1β（IL-1B），过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）等靶点。

2.3 GO和KEGG富集分析

将27个核心靶点上传至String进行GO和KEGG富集分析，筛选P<0.05的分析结果，GO富集得出869条结果，其中生物过程（BP）790条，包括脂质代谢过程的正调控、对内源性刺激的反应、对激素的反应、多细胞生物过程的调控等；细胞组成（CC）18条，包括细胞外空间、细胞外区域、细胞质、内质网腔等；分子功能（MF）61条，包括信号受体结合、蛋白质结合、受体配体活性、抗氧化活性等。其中GO各条目显著性前10的分析结果（见图3）。

图3 GO富集分析结果

KEGG通路富集相关通路103条，此部分列举了显著性前20的条目（见图4）。由图4可以看出复方可能作用于TNF信号通路（TNF signaling pathway），破骨细胞分化（osteoclast differentiation），肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system），Toll样受体信号通路（toll-like receptor signaling pathway）等多条通路治疗泌尿系结石。

图4 KEGG富集分析结果

2.4 核心成分-靶点的结合模式

整理“成分-靶点”作用网络中自由度TOP5的活性成分，借助分子对接技术对活性成分最相关的靶点AR（2PIU）和TNF（1OQE）进行半柔性对接以探索它们互作的模式，最后进行分析结果可视化（见图5）。核心成分中不饱和脂肪酸类化合物的网络参数自由度较高，它们多数作用于核心靶点AR和TNF。分子动力学模拟结果显示Hexadecylic Acid、Lauric Acid、Myristic Acid和Stearic Acid与AR残基ARG结合较好，Linolenic Acid与TNF的HIS16可以形成氢键，所有成分与对应的靶点结合能小于0，都可以自由结合，它们可能在排石汤治疗泌尿系结石的生物学机制中发挥重要的作用。

图5 TO5核心成分与相关靶点的结合模式

3 讨论

泌尿系结石为泌尿系统常见疾病，可发生于肾、输尿管、膀胱及尿道等任意部位，结石长到5mm以上，可能会导致输尿管阻塞，导致下背部或腹部严重疼痛，结石还可能导致尿血，呕吐或排尿疼痛，大约有一半患有肾结石的人将在十年内再患结石。许多危险因素影响泌尿系结石的发生发展，饮食是重要因素之一，饮食中动物蛋白，钠，糖的高摄入量，以及过多摄入果汁可能会由于尿酸排泄量增加而增加泌尿系结石形成的风险。目前，关于泌尿系结石的生物学机制研究较少，洞悉其生物学机制有利于尽早实现精准治疗。中医药秉持整体观念和辨证论治的诊治原则在疾病的预防、治疗和保健方面发挥着重要的作用。此外，中药及其天然产物是新药发现的重要途经和有力工具，较为经典的抗疟药青蒿素，抗白血病药物三氧化二砷，抗癌药物紫杉醇都挖掘自中药和天然产物。我院自制的排石汤由9种具备清热解毒，利尿排石功效的药材组成，在治疗泌尿系结石方面具有很好的疗效。

本研究借助网络药理学的方法预测了排石汤的潜在靶点和相关通路，为后续排石汤的生物学机制和治疗泌尿系结石的先导化合物的开发提供支撑。通过网络药理学的相关参数计算，发现了排石汤排石汤中的薄荷酮，油酸，亚油酸，亚麻酸，硬脂酸，没食子酸，姜黄素，异三叶素，丹参酮和丹参酚等核心化合物（见图1）通过调控肿瘤坏死因子（TNF），前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2），血管紧张素转化酶（ACE），立早基因（JUN），白细胞介素1β（IL-1B），过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）等27个核心靶点发挥治疗泌尿系结石的作用，它们共同调节了TNF信号通路（TNF signaling pathway），破骨细胞分化（osteoclast differentiation），肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system），Toll样受体信号通路（toll-like receptor signaling pathway）等多条通路（见图4），它们是排石汤治疗泌尿系结石的潜在作用机制。

据报道，晶胞相互作用是尿结石形成中最关键的步骤之一，高草酸尿症诱导的肾小管上皮细胞凋亡变化是这种相互作用的终点，重要的是TNF转导途径可以促进肾小管细胞凋亡这一进程。草酸钙是大多数尿结石的主要成分，高草酸尿症是特发性肾结石的主要危险因素之一，肾小管细胞在高水平的草酸盐或草酸钙晶体状态下受到明显损伤，这与氧化应激的发展和活性氧（ROS）的过量生产有关，细胞内ROS主要由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和线粒体产生，并参与多种信号传导途径。在暴露于高水平的草酸盐或草酸钙晶体期间，NADPH氧化酶已成为受体介导的ROS产生的主要来源。NADPH氧化酶的激活增加了ROS的生成，而ROS可以调节几种与石头有关的大分子的表达，从而促进肾结石的形成[7～9]。肾素-血管紧张素系统可能在高草酸尿大鼠的肾脏结晶和ROS产生中起重要作用[10～12]。本研究的KEGG富集分析结果显示排石汤可以作用上述关键通路，它们可能是重要的治疗途径。此外，一项以大鼠为研究对象的Toll样受体在肾结石引起的继发性炎症反应的结果显示受体的亚型发生变化，可能是泌尿系结石的标识受体[13]。而本研究的结果显示排石汤可会作用这一受体发挥药理活性。另外，本研究的代谢通路富集分析结果显示泌尿系结石的发生发展可能与典型的NF-kB信号通路和MAPK信号通路相关，其中IL1B，PTGS2，TNFSF11，TNF参与了NF-kB信号通路，IL1B，FGF2，JUN，INS，TNF参与了MAPK信号通路，Yusuf Ozlem Ilbey[14]等人通过大鼠实验发现上述两种经典的信号通路可以诱导大鼠肾脏氧化应激和结石形成，因为p38-MAPK和NF-kB途径在多种肾脏炎性疾病实验模型中被激活，包括抗肾小球基底膜肾炎，输尿管阻塞，内毒素血症和免疫性复杂性肾炎。此外，作为MAPK的同工酶，p38-MAPK直接影响胶原蛋白的表达参与了动脉粥样硬化的发作，草酸钙结石形成过程中，p38 MAPK信号通路介导了上皮细胞紧密连接的破坏，p38 MAPK信号通路相关蛋白的表达水平上调[15]。重要的是，自拟排石汤的网络药理学预测显示可以调节NF-kB信号通路和MAPK信号通路，可能通过调节氧化应激反应治疗泌尿系结石。应用分子对接的策略对排石汤的关键成分和作用靶点的进行了验证（见图5），结果发现脂肪酸类化学成分与AR和TNF的残基可以自由结合，排石汤可能与它们作用产生治疗作用。本研究应用网络药理学和分子对接技术预测我院自拟排石汤治疗泌尿系结石的分子机制，自拟排石汤通过调节TNF，PTGS2，JUN，IL-1B，AR等核心靶点，肾素血管紧张素系统，Toll样受体信号通路，TNF信号通路，NF-kB和MAPK等核心通路治疗泌尿系结石。由于数据库的选择以及更新的差异，研究结果可能存在不足，更多的机制需要后续的生物学实验的设计和验证。

4 展望

综上所述，应用网络药理学和分子对接分析方法发现了排石汤治疗泌尿系结石的潜在分子机制，多靶点-多途径的治疗特点与中医药治疗疾病的整体观念不谋而合，排石汤通过调控与炎症反应和氧化应激密切相关的靶点和通路发挥治疗作用。中医药对于医药健康领域一个伟大的宝库，需要更好的开发和利用，相信借助现代分析技术使得更多人们科学认知中医药，受益于中医药。