三七总皂苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响*

随蓓蓓 李华舜 孟 晓 孙秀玲 刘 莉

(济宁医学院生物科学学院,日照 276826)

三七，别名田七，我国主要生产地为云南、广西等地[1]。三七主要通过其含有的皂苷类物质发挥药用作用[2]。三七总皂苷大多数可分为达玛烷型的20(S)-原人参二醇和20(S)-原人参三醇2种类型[3]。有研究发现，三七总皂苷能抑制癌细胞增殖、生长、促进癌细胞凋亡[4]。常规化疗手段与三七总皂苷联合使用既能降低化疗手段的副作用又可发挥抗肿瘤的疗效，在临床治疗中对延长患者生存期有重要意义[5]。因此，三七总皂苷对肿瘤治疗有十分重要的临床意义，值得深入研究。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231细胞(ATCC)购自上海研生生化试剂有限公司；FBS和DMEM为Gibco产品；三七总皂苷为实验室自提取；细胞凋亡试剂盒和Casepase 3活性检测试剂盒为碧云天产品。人乳腺癌细胞MDA-MB-231使用含FBS 10%的高糖DMEM培养基，37℃、5% CO2条件下进行传代培养。

1.2 方法

1.2.1人乳腺癌细胞MDA-MB-231的活性检测 将细胞接种于96孔板，待铺满细胞培养板80%时开始处理。分别设空白对照组及不同浓度的三七总皂苷处理组。空白对照组加入DMEM培养基，三七总皂苷处理组分别加入终浓度含0.5、1.0、2.0mg/ml三七总皂苷的DMEM培养基。每组每个时间段设置3个平行孔。取出96孔板，将每个待测孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，37℃、5% CO2孵育4h。终止孵育，弃去孔内溶液，加入适量PBS，清洗两次。每孔精确加入DMSO 150μl，低速振荡10min，酶标仪490nm波长下检测各孔的吸光值。以平均吸光值为纵坐标，以时间为横坐标，绘制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的吸光值曲线。

1.2.2人乳腺癌MDA-MB-231细胞的光镜观察 将细胞接种于6孔板，待细胞铺满80%的时候。同上设置空白对照组和实验组，实验组分别加入0.5、1.0和2.0mg/ml三七总皂苷，置于二氧化碳培养箱中继续培养24h。用0.25%的胰酶消化不同浓度三七总皂苷处理过的MDA-MB-231，吹打至均匀，1000r/min，离心5min，弃上清。将沉淀的细胞与台盼蓝染液(9∶1)混合均匀。将混合液1000r/min，离心5min，弃上清液，加PBS清洗，再次离心，弃上清。重复3次，至细胞清洗干净。将细胞沉淀加入适量PBS制成细胞悬液，滴在载玻片上，制成标本，置于显微镜下观察、拍照。

1.2.3人乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡检测 将细胞接种于6孔板内，待细胞铺满80%，同上设置空白对照组和实验组。实验组分别加入0.5、1.0和2.0mg/ml三七总皂苷，吸尽培养液，每孔加入0.5ml固定液，固定30min。弃去固定液，用适量PBS清洗两次，每次2min。每孔加入0.5ml染液，晃动染色5min。弃去染液，加入适量PBS， 晃动清洗两遍，每次2min。加入抗荧光淬灭剂，置于荧光倒置显微镜下观察拍照。

1.2.4Casepase3酶活检测 分别加入0.5、1.0、2.0mg/ml浓度的三七皂苷处理12h后，将空白对照组和实验组细胞600r/min，4℃离心5min收集细胞，PBS洗涤1次。按照每200万细胞加入100μm裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15min。然后，15000r/min，4℃离心10min。将上清转移到冰浴预冷的离心管中，-70℃保存样品。取出适量的Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用。如表1配制反应体系，加入Ac-DEVD-pNA(2mM)后混匀，37℃孵育1h。酶标仪检测样品A405吸光度，利用pNA浓度相对于A405的标准曲线，y=0.0025x，R2=0.99，求取样品pNA浓度。一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃ 1h内可以剪切1nmol Ac-DEVD-产生pNA1nmol pNA的caspase 3的酶量，由此计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 3。

表1 反应体系

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞活性变化情况

在0.5～2mg/ml三七总皂苷处理后，人乳腺癌MDA-MB-231细胞的吸光度值随着浓度升高和作用时间延长而不断降低，具有时间和浓度依赖性。见图1。

图1 MDA-MB-231的活性检测曲线

2.2 各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞光镜观察结果

空白对照组细胞形态为圆形或卵圆形且大小均一，细胞膜表面光滑。0.5mg/ml三七总皂苷组细胞产生了轻微的空泡化。1mg/ml三七总皂苷组细胞形态改变、结构紊乱，且细胞膜边缘出现大量的凋亡小体。2mg/ml三七总皂苷组细胞形态改变、结构紊乱、出现大量的凋亡小体和细胞碎片。见图2。

注：A.空白对照组,24h；B.0.5mg/ml三七总苷组,24h；C.1.0mg/ml三七总苷组,24h；D.2.0mg/ml三七总苷组,24h;标尺=50μm

2.3 各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡情况

空白对照组细胞核形态正常，荧光强度均一，相对较弱。0.5mg/ml三七总皂苷组细胞核形态，与空白对照组相比，变化不明显。1.0mg/ml三七总皂苷组细胞核，形态改变、固缩变小，有的甚至呈碎块状，荧光强度变强。2.0mg/ml三七总皂苷组细胞核，亦出现了形态改变、固缩变小、结构紊乱，荧光增强的特征。见图3。

注：A.空白对照组,12h；B.0.5mg/ml三七总苷组,12h；C.1.0mg/ml三七总苷组,12h；D.2.0mg/ml三七总苷组,12h;标尺=20μm

2.4 各组Casepase3酶活力变化情况

0.5、1.0和2.0mg/ml三七总皂苷处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞12h后，Casepase 3酶活力不断提高，与浓度呈正相关。与空白对照组相比，Casepase 3酶活力增加显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；**P<0.01

3 讨论

现代生活中，乳腺癌是女性中常见的一种疾病，患者人数逐年攀升，已成为困扰我国女性健康的重大疾病之一[6-7]。化疗、放疗等常规治疗手段对机体的毒副作用严重，寻求高效、低毒的新型抗癌药物，成为当前国内外研究的热点。三七总皂苷作为天然药物，来源广泛，对正常的细胞毒性较低，能抑制多种癌细胞的增殖，具有诱导凋亡的作用。三七总皂苷与常规化疗手段联合使用，对改善临床患者的生存质量，发挥着重要作用。研究表明，三七总皂苷对肝癌细胞SMMC-7721和白血病NB4细胞的增殖均有直接的抑制作用，且随着药物浓度增加，抑制作用增强，有药物浓度依赖性[8-9]。三七总皂苷处理白血病HL-60细胞后，细胞出现凋亡，说明三七总皂苷有促进细胞凋亡的作用，且这种作用随药物浓度增大而增加[10]。本文结果显示，与空白对照组相比，浓度为0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml三七总皂苷可降低人乳腺癌MDA-MB-231细胞的活性，且具有时间和浓度依赖性； Casepase 3酶活力增加显著，差异具有统计学意义，说明三七总皂苷能有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和活性，并具有促凋亡作用。此实验结果可为乳腺癌临床相关治疗提供用药参考，也为三七总皂苷基础研究提供数据支持。