短时间微流水处理对草鱼鱼肉风味品质的影响

阮秋凤，安玥琦，陈 周，尤 娟，熊善柏，*

(1.华中农业大学 食品科学技术学院， 湖北 武汉 430070；2.长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心， 湖北 武汉 430070；3.国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心(武汉)， 湖北 武汉 430070)

草鱼(Ctenopharyngodonidella)是我国淡水鱼养殖的四大家鱼之一，2019年我国草鱼养殖产量达553.31万t，居全国淡水养殖产量第一[1]。池塘养殖草鱼存在高密度养殖，淤泥沉积，藻类、放线菌或真菌繁殖，运输过程易产生应激反应等问题[2]；且池塘养殖草鱼鱼肉易产生不良风味物质，导致其风味品质下降。目前，改善水产品品质尤其是风味品质是该领域的热点研究方向，因此研究养殖草鱼风味品质提升技术具有一定的实践指导意义。

在宰杀前对鱼体进行短时间的微流水处理是提升鱼体品质的常用技术之一。微流水处理是指将人工养殖的鱼类转移至清洁和流动的水体中进行低密度的停食暂养，以减少鱼类的宰前应激反应。微流水处理可显著减少鱼类不良风味物质的累积，有利于鱼体质构品质的提高和风味品质的改善[3-5]。已有研究对太平洋鲑鱼[6]、鳕鱼[7]等海水产品，鲫鱼[8-9]、团头鲂[10]、草鱼[11]等淡水鱼进行微流水处理，发现鱼肉的理化指标和食用品质均得到改善，但是这些研究均没有系统地对水产品尤其是草鱼中气味和滋味物质及其前体物质的变化规律开展研究。

在前期研究[11]的基础上，本研究拟对池塘养殖草鱼进行0、1、4、7 d微流水停食暂养处理。采用全二维气相色谱- 飞行时间质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOF MS)技术和基于液相色谱- 质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)技术的代谢组学方法，研究微流水处理对草鱼鱼肉气味成分和滋味成分的影响，探究微流水处理对草鱼鱼肉风味品质的影响机制，以期为开发优质调理水产品提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

池塘养殖的草鱼成鱼，产地为湖北省钟祥市，质量为1.6～1.7 kg/尾。邻二氯苯、甲醇，均为色谱纯，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DVB/CAR/PDMS型固相微萃取头，美国Supelco公司；Pegasus 4D型全二维气相色谱- 飞行时间质谱仪，美国Leco公司；2D型超高效液相色谱仪，美国Waters公司；Q Exactive型高分辨质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1微流水处理方法

池塘养殖草鱼的微流水处理方法参照文献[11]的方法。

1.3.2气味和滋味评价

草鱼鱼肉在蒸柜中蒸15 min后进行气味和滋味评定。由6位品评员(3男、3女)对草鱼鱼肉进行评价。气味和滋味的评价标准参照文献[11]的方法。

1.3.3GC×GC-TOFMS分析

参考文献[12]的方法，略有修改。取2.5 g绞碎的鱼肉放入20 mL顶空瓶中，加入2.5 mL NaCl溶液(0.18 g/mL)，并加入100 μL邻二氯苯溶液做内标。采用30/50 μm DVB/CAR/PDMS纤维头，对样品进行SPME萃取。50 ℃下孵育20 min，萃取时间为50 min，然后迅速在GC进样口中解吸附5 min。按照设定参数进行GC×GC-TOFMS分析。

仪器参数：第一维柱DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，进样温度250 ℃，初始柱温40 ℃，保留2 min，以5 ℃/min升至60 ℃，保留2 min，然后以5 ℃/min升至250 ℃，保留2 min，氦气(99.999 9%)流速为1.0 mL/min，不分流；二维柱DB-17MS (2 m×100 μm×0.10 μm)，柱温始终高于第一维柱5 ℃，调制解调器温度始终低于第一维柱15 ℃；全二维分析时调制周期4.0 s，接口温度270 ℃，离子源温度220 ℃，电子轰击源70 eV，检测器1 680 V，采集率100张/s。质谱扫描范围m/z：33～550。

风味物质的定性参考NIST谱库，结合各挥发物的保留指数(retention index，RI)对物质进行定性[13]。采用内标法进行半定量分析，通过计算挥发性物质的峰面积和内标邻二氯苯的峰面积之比得到物质的相对含量，以比较在暂养处理过程中风味物质的变化规律。

1.3.4LC-MS/MS分析

采用超高效液相色谱串联高分辨质谱仪进行微流水暂养过程中草鱼肉滋味成分变化的测定，6次平行实验。

色谱条件：BEH C18型色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；正离子模式流动相为含体积分数为0.1%甲酸的水溶液(A液)和含体积分数为0.1%甲酸的100%甲醇(B液)，负离子模式流动相为含10 mmol/L甲酸氨的水溶液(A液)和含10 mmol/L甲酸氨的95%甲醇(B液)。采用梯度洗脱方法进行洗脱：0～1 min，2% B液；1～9 min，2%～98% B液；9～12 min，98% B液；12～12.1 min，98% B液～2%B液；12.1～15 min，2% B液。流速为0.35 mL/min，柱温45 ℃，进样量为5 μL。

质谱条件：利用高分辨质谱仪进行一级、二级质谱数据采集。质谱扫描质核比为70～1 050，一级分辨率为70 000，最大注入时间为100 ms。按照母离子强度，选择Top 3进行碎裂，采集二级信息，二级分辨率为17 500，最大注入时间为50 ms，碎裂能量设置为：20、40、60 eV。离子源参数设置：鞘气流速为40 mL/min，辅助气流速为10 mL/min，喷雾电压正离子模式为3.80，负离子模式为3.20，离子传输管温度为320 ℃，辅助气加热温度为350 ℃。

1.3.5相对气味活度值的计算

关键气味物质的确定[14]：采用相对气味活度值(relative odor activity value，ROAV)确定挥发性物质的贡献程度。设定对风味贡献最大的物质ROAVstan=100，ROAV计算公式见式(1)。

(1)

式(1)中，Cr,stan为风味贡献最大物质的相对含量；Tstan为风味贡献最大物质的阈值，μg/kg；Cr,i为各挥发性物质的相对含量；Ti为各挥发性物质的阈值，μg/kg。所有组分0≤ROAV≤100，ROAV越大的组分对样品总体风味贡献越大。

1.4 数据处理

所有数据采用SPSS 22软件进行方差分析，显著差异检测限P<0.05，极显著差异检测限P<0.01，应用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 微流水处理对草鱼鱼肉气味和滋味的影响

对各处理组草鱼鱼肉的气味和滋味进行感官评价，感官评分标准参照文献[11]，并略有修改，见表1。感官评价结果如图1，由图1可知，微流水处理能明显提高草鱼鱼肉的气味和滋味评分。随着微流水处理时间的延长，草鱼鱼肉的气味和滋味评分显著上升，且暂养4 d的草鱼鱼肉的气味和滋味评分显著高于未处理样品(P<0.05)，但与处理7 d的相比较无显著差异(P>0.05)。

表1 感官评分标准Tab.1 Sensory evaluation standard

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图1 微流水处理对草鱼鱼肉气味和滋味的影响Fig.1 Effect of micro-flow water treatment on odor and flavor in grass carp muscle

2.2 微流水处理对草鱼鱼肉挥发性成分的影响

经GC×GC-TOFMS测定后，微流水处理过程中草鱼鱼肉挥发性气味物质数量的变化如图2。由图2可知，在草鱼鱼肉中含有较多的醛类、酮类和醇类化合物。微流水处理减少了草鱼鱼肉中醛类、酮类、酸类物质的数量，但随着微流水处理时间的延长，草鱼鱼肉中酯类物质的数量增加。

图2 微流水处理对草鱼鱼肉挥发性 成分数量的影响Fig.2 Effect of micro-flow water treatment on amount volatile components in grass carp muscle

微流水处理过程中草鱼鱼肉的主要挥发性气味物质及相对含量如表2。由表2可知，草鱼鱼肉中含有较多的醛类化合物。随着处理时间的延长，微流水处理降低了草鱼鱼肉中呈刺激气味、青草味或鱼腥味的饱和脂肪醛的相对含量；而对于呈青草味或油脂味的单不饱和脂肪醛而言，除(E)-2-戊烯醛和(E)-2-己烯醛外，大部分单不饱和脂肪醛在处理4 d后相对含量增加；(E,E)-2,4-己二烯醛的相对含量在处理4 d后最低，而呈青瓜味、青草味或花香味的(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛的相对含量随着处理天数的增加呈上升趋势。微流水处理对呈甜味的含苯环的芳香醛的相对含量没有太大影响。

草鱼鱼肉中的酮类化合物种类较多。由表2可知：随着处理天数的增加，呈溶剂味的2-丁酮、呈刺激性气味的3-戊酮、呈油脂味的3-庚酮等脂肪酮的相对含量呈下降趋势；对于不饱和酮，呈蘑菇味的1-辛烯-3酮和呈青草味的(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮的相对含量呈上升趋势，呈油漆味的1-戊烯-3-酮在处理1～4 d时相对含量较低，除此之外的不饱和酮的相对含量呈下降趋势；微流水处理对呈甜味的苯乙酮这一芳香酮的影响不明显。

表2中，在室内微流水处理4～7 d时，草鱼鱼肉中除了呈青草味的(E)-2-辛烯-1-醇的相对含量升高，其他呈青草味、溶剂味或水果味的脂肪醇的相对含量呈下降趋势，在第4天或第7天达到最小值。随着处理天数的增加，呈花香味的苯甲醇这一芳香醇的相对含量则没有很明显的变化。

表2 微流水处理对草鱼鱼肉挥发性气味成分的影响Tab.2 Effect of micro-flow water treatment on volatile odor components in grass carp muscle

续表2

由表2可知：随着处理时间的延长，草鱼鱼肉中呈水果味的酯类化合物相对含量从总体上呈下降趋势，而酸类物质的相对含量在处理4 d后达到最大值；呈煳味的呋喃类化合物2-乙基呋喃的相对含量随着处理时间的延长逐渐降低；内酯类化合物检测出了呈甜味和黄油味的丁内酯，其相对含量在处理1 d后达到最大值，而后相对含量逐渐降低。

通过GC×GC-TOFMS分析，在草鱼鱼肉中共检测出4种含氮化合物，包括吡啶、苯并噻唑、三甲胺和三正丙胺。这些含氮化合物均具有鱼腥味，被认为是水产品的主要异味来源[15]。随着处理时间的延长，这4种含氮化合物的相对含量均下降，尤其是处理7 d后，不再检测到苯并噻唑和三正丙胺。

表2结果表明，微流水处理可以减少草鱼鱼肉中青草味、鱼腥味、油脂味等不良气味物质的含量，同时也会影响到呈水果味的酯类物质，但对芳香类的羰基化合物和醇类物质影响不大；故须确定草鱼鱼肉中的关键挥发性化合物，来判断草鱼鱼肉整体气味变化情况。

2.3 微流水处理对草鱼鱼肉关键气味成分的影响

气味活度值(odor activity value, OAV)是挥发性化合物的绝对浓度与其感觉阈值的比值，当浓度一定时，阈值越低的化合物越容易被感知；当阈值一定时，浓度越高的化合物越容易被感知。将浓度与阈值结合在一起，可以客观地表明每种挥发性化合物对样品总体香气的贡献。在已知挥发性化合物相对含量的条件下，采用ROAV确定不同处理时间的草鱼鱼肉中关键气味物质。在每一组样品中，具有蘑菇味的1-辛烯-3-酮具有最高的OAV，故取1-辛烯-3-酮的ROAV为100，计算每组样品中其他物质的ROAV。在本研究中，选取ROAV≥1.0的化合物为样品的关键气味物质，认为0.1≤ROAV<1.0的化合物对样品的总体风味具有一定的修饰作用。

微流水处理后草鱼鱼肉气味物质的ROAV测量结果见表3。由表3可知，在未处理的草鱼鱼肉中具有最多的关键气味成分，包括1-辛烯-3酮、(Z)- 4-庚烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、己醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛 、1-辛烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛、丁酸甲酯、1-戊烯-3-酮、庚醛、2-乙基呋喃、壬醛、(E)-2-戊烯醛、(E)-2-辛烯醛和1-庚醇。随着室内微流水处理天数的延长，草鱼鱼肉中的关键气味成分种类逐渐减少。在处理1 d后，具有绿霉味的(E)-2-戊烯醛不再是草鱼鱼肉的关键气味成分；在处理4 d后，具有青草味的己醛不再对草鱼鱼肉的气味具有主要贡献；当处理7 d后，庚醛、2-乙基呋喃、壬醛、(E)-2-辛烯醛和1-庚醇均不再是草鱼鱼肉的关键气味成分。由此可知，微流水处理可显著减少草鱼鱼肉中关键气味成分，尤其降低了具有青草味、绿霉味的气味物质的贡献。

表3 微流水处理草鱼鱼肉关键气味物质的相对气味活度值Tab.3 ROAVs of key odor compounds in grass carp muscle after micro-flow water treatment

续表3

2.4 微流水处理对草鱼鱼肉滋味成分的影响

本研究采用高分辨率质谱仪对不同处理时间的草鱼鱼肉中的非挥发性物质进行分离鉴定，分析结果见表4。由表4可知：微流水处理显著增加了草鱼鱼肉中的谷氨酸和谷氨酰胺的相对含量(P<0.05)，有助于草鱼鱼肉鲜味的增强；异亮氨酸和亮氨酸在处理1 d时的相对含量显著降低(P<0.05)，可能影响草鱼鱼肉中支链风味化合物的形成；赖氨酸、组氨酸、丝氨酸和缬氨酸的相对含量在处理4 d时显著上升(P<0.05)；具有甜味的甘氨酸和苏氨酸相对含量变化不存在显著性差异(P>0.05)，但含量呈上升趋势；呈苦味的精氨酸的相对含量在处理4 d时显著降低(P<0.05)。呈味氨基酸的变化趋势与本实验室前期采用氨基酸自动分析仪测定草鱼鱼肉中的游离氨基酸的变化趋势大致一致[11]。

表4 微流水处理时间对草鱼鱼肉中主要滋味成分相对含量的影响Tab.4 Effect of micro-flow water treatment time on relative contents of main flavor components in grass carp muscle

鱼类死后肌肉中的三磷酸腺苷含量下降，进一步分解生成二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、肌苷酸、肌苷和次黄嘌呤。由表4可知，通过高分辨率质谱仪共检测出鸟苷酸、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、肌苷、次黄嘌呤5种核苷酸及其降解物，其中一磷酸腺苷、肌苷酸和次黄苷酸代谢生成的鸟苷酸具有鲜味，次黄嘌呤具有苦味。在处理4 d时，二磷酸腺苷和鸟苷酸的相对含量显著降低(P<0.05)，一磷酸腺苷的相对含量在处理1 d时显著升高(P<0.05)，而肌苷和次黄嘌呤的相对含量分别在处理1 d和4 d时显著下降。根据三磷酸腺苷的降解途径，可以发现，微流水处理有助于呈鲜味的一磷酸腺苷在处理1 d后得到积累，同时抑制了一磷酸腺苷降解为具有苦味的次黄嘌呤。吕昊[20]采用湖泊微流水对草鱼处理的研究中发现，停食产生的饥饿胁迫诱导肌肉嘌呤代谢路径发生显著变化，使得鱼肉中肌苷酸和部分呈味氨基酸得到积累，本研究也得到类似的实验结果，说明微流水处理可以使鱼肉的鲜味和甜味得到显著改善。

表4显示，使用高分辨率质谱仪，在不同处理时间的草鱼鱼肉中检测出了5种有机酸、2种糖类和1种有机碱。其中磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸等酸类相对含量与未处理组不存在显著性差异(P>0.05)，草酸在处理4 d时相对含量显著下降(P<0.05)，糖类的相对含量在处理4 d后显著升高(P<0.05)，具有甜味的甜菜碱的相对含量在处理4 d后显著升高(P<0.05)。

鱼肉的滋味不是单个物质的呈现，而是各种滋味成分协同作用使得整体呈现独有的滋味特征。本研究结果说明，微流水处理有利于提升鱼肉的鲜味和甜味，并降低鱼肉中苦味物质的含量，可改善鱼肉的风味品质。

2.5 微流水处理对草鱼鱼肉风味前体物质的影响

鱼体中的一些物质如小分子肽[21]、有机碱[22]和不饱和脂肪酸[23]等对风味贡献较小，但能通过氧化、酶催化、降解等途径形成风味物质，是水产品中重要的风味前体物质。通过高分辨率质谱仪检测到不同处理时间的草鱼鱼肉中的风味前体物质，结果如表5。由表5可知，微流水处理1 d后谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的相对含量显著上升(P<0.05)；微流水处理后草鱼鱼肉肉碱相对含量降低，说明停食导致草鱼体内食物源的肉碱摄入下降；微流水处理后，大部分多不饱和脂肪酸的相对含量增加，表明多不饱和脂肪酸的合成增强。研究结果与鳕鱼[24]、团头鲂[10]停食处理过程中脂肪酸的变化类似。

表5 微流水处理时间对草鱼鱼肉中风味前体物质相对含量的影响Tab. 5 Effect of micro-flow water treatment time on relative content of flavor precursors in grass carp muscle

2.6 草鱼鱼肉的风味物质与风味前体物质的相关性分析

微流水处理后草鱼鱼肉的挥发性物质含量与气味得分的相关性分析结果见表6，滋味物质含量与滋味得分的相关性分析结果见表7。由表6可知，与气味得分相关性系数较大的挥发性物质有19种，其中与气味得分呈显著负相关的有青草味的己醛、焦糖味的2,3-戊二酮、煳味的2-乙基呋喃、刺激性气味的吡啶4种物质，表明微流水处理后草鱼鱼肉气味得分提高与这4种物质含量的降低有关。由表7可知，与滋味得分相关性系数较大的滋味物质有7种，其中与鸟苷酸和草酸呈显著负相关。鸟苷酸是一种鲜味核苷酸，可能是在微流水处理过程中的停食导致鸟苷酸含量的降低。滋味得分与呈鲜味的谷氨酸和呈甜味的丝氨酸、赖氨酸和蔗糖等物质呈正相关。将多不饱和脂肪酸与挥发性气味成分进行相关性分析，结果见表8。表8显示，与多不饱和脂肪酸呈显著性相关的挥发性气味成分大多为醛类、酮类、醇类和酯类。其中，与多不饱和脂肪酸呈负相关的挥发性气味成分可推测为多不饱和脂肪酸的代谢产物[25]。脂肪氧合酶可通过分子加氧催化氧化不饱和脂肪酸基团附近的C—C键，使其断裂生成羰基化合物和醇类[26]。相同的挥发性物质可能是由不同的不饱和脂肪酸经脂肪酶或脂肪氧合酶催化氧化的产物，这仍需进一步实验进行验证。

短时间微流水处理导致多不饱和脂肪酸得到一定量的积累，使得挥发性气味成分含量降低，即草鱼鱼肉中的青草味和鱼腥味物质含量降低，与此同时，鲜味和甜味物质含量增加，改善了鱼肉的风味品质。

表6 挥发性物质与气味得分的相关性Tab.6 Correlation of volatile compounds and odor score

表7 滋味物质与滋味得分的相关性Tab.7 Correlation of flavor substances and taste scores

3 讨 论

目前，对微流水处理的草鱼[27]、鲫鱼[28]、鳙鱼[29]、团头鲂[10]、罗非鱼[30]、鳕鱼[24]、太平洋鲑[6]等水产品进行氨基酸、脂肪酸、总糖、挥发性盐基氮等理化成分、质构特性、电子鼻分析及感官评价的测定结果表明，微流水处理可增加鱼肉的鲜度，改善鱼肉的肉质及风味品质[31]。本研究进一步确定，微流水处理可显著减少草鱼鱼肉中关键的不良气味成分，尤其降低了具有青草味、绿霉味、鱼腥味的己醛、(E)-2-戊烯醛、庚醛、2-乙基呋喃、壬醛、(E)-2-辛烯醛和1-庚醇等气味物质的贡献；亦增加了具有鲜味和甜味的氨基酸、核苷酸、有机碱和糖类物质的含量，提高草鱼鱼肉的滋味品质；同时研究了草鱼鱼肉中的风味前体物质与气味和滋味成分的相关性，揭示微流水处理改善草鱼鱼肉的风味品质的机制。

表8 多不饱和脂肪酸与挥发性气味成分的相关性Tab.8 Correlation of polyunsaturated fatty acids and volatile odor components

本研究中草鱼经微流水处理后，鱼体内多不饱和脂肪酸含量显著升高(P<0.05)，推测是因为处理时间较短，鱼类体内的脂肪酸代谢通路发生改变，在停食处理后倾向于先利用机体中的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，而保存多不饱和脂肪酸[10,32-33]。多不饱和脂肪酸的氧化分解是鱼肉中脂肪醛、脂肪酮、脂肪醇等气味化合物的重要来源[25,34]，微流水处理后不饱和脂肪酸含量的上升，这可能是导致处理后草鱼鱼肉中大部分脂肪醛和脂肪醇含量下降的原因。

微流水处理后草鱼鱼肉中谷氨酸和谷氨酰胺含量显著上升，说明微流水处理改变了谷氨酸的代谢。有研究表明，当氨氮环境发生改变，谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶表达量发生改变，谷氨酸代谢发生显著变化[26-35]，而本实验中草鱼从高氨氮环境的养殖水体转移到低氨氮环境的微流水体中，谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶的表达量可能发生变化，导致谷氨酸积累上调。谷氨酸是鱼肉中重要的呈鲜味游离氨基酸，其含量上升有利于提升鱼肉的鲜味；同时谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量升高，代谢生成的谷氨酸相对含量增加，表明微流水处理后鱼体内的氧化还原代谢发生改变，变化趋势与海产品在饥饿状态下机体中谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的变化一致[36]。经微流水处理后，草鱼鱼肉中对鲜味和甜味有贡献的氨基酸、核苷酸、有机碱和糖类物质得到积累，同时降低了次黄嘌呤、精氨酸等苦味物质，这有可能是微流水处理改变了草鱼的氨基酸分解代谢、核苷酸代谢通路[37-38]，使得核苷酸和呈味氨基酸积累，从而提升草鱼鱼肉的滋味品质。鱼肉中柠檬酸和苹果酸含量增加，有利于体内氨基酸的利用，对鱼肉的滋味品质有一定的影响，有机酸含量的变化可能与脂肪、氨基酸或糖类代谢有关[39]。

4 结 论

本研究对池塘养殖草鱼进行微流水处理，使得草鱼鱼肉的代谢通路发生改变，多不饱和脂肪酸相对含量增加，谷氨酸和谷氨酰胺含量显著上升，降低了对鱼腥味、青草味有贡献的己醛、庚醛、辛醛、壬醛的含量，降低了具有鱼腥味、油脂味的(E)-2-辛烯醛和具有发酵味的1-庚醇的含量；同时呈鲜味和甜味的氨基酸和核苷酸含量累积，呈苦味的氨基酸含量逐渐降低。本研究表明，微流水处理可在短时间(4～7 d)内通过改变草鱼体内的氨基酸、核苷酸、不饱和脂肪酸的代谢通路来提高草鱼鱼肉的风味品质。