双夏汤对肝郁型失眠大鼠行为学和脑内单胺类神经递质的影响

刘 悦，裴文慧,2，王 冉，牛芬溪，刘雅楠，孙毅坤，方 芳

(1. 北京中医药大学中药学院，北京 102488；2. 北京地坛医院顺义院区，北京 101300)

失眠是一种常见的睡眠障碍，主要表现为入睡困难、睡眠维持时间短、早醒，伴有精神及生理功能的日间损害等，长期失眠可严重影响人们的健康。随着时代的发展和生活节奏的加快，失眠患者的比例越来越高，失眠已经成为一个公共卫生事件而受到关注[1-2]。调节脑内γ-氨基丁酸作用的苯二氮类药物如安定、唑吡坦、扎来普隆常作为治疗慢性失眠的一线药物，具有改善夜间睡眠的作用，但长期应用具有明显不良反应，使得人们寻找γ-氨基丁酸以外靶点的药物及非药物治疗方式[3]。失眠在中医学中属于“不寐”的范畴，根据失眠患者的表型和病因进行辨证分析发现，肝郁型失眠比例较高。“肝主疏泄”，肝之疏泄功能正常可以使气血通畅、心神滋养，而肝气郁结则神魂失养而致失眠，或肝气郁结化火，炼液为痰，痰火上扰心神引起失眠[4-5]。双夏汤由半夏、夏枯草等量煎煮而成，对古今医家临床治疗失眠的用药规律分析显示，半夏的使用频率较高，其与夏枯草等量配伍使用最常见，是治疗失眠的核心药对[6-8]。夏枯草具有清肝火、散郁结作用，半夏有燥湿化痰功效，二者合用可疏肝解郁、化痰理气，对肝郁火旺、痰热内扰型失眠有较好疗效[9]。本课题组前期研究显示，双夏汤水煎液冻干粉能有效改善年老年果蝇的片段式睡眠，在治疗夜间间歇性失眠的同时，并未显著影响果蝇白天的活动，有助于果蝇睡眠-觉醒节律的调节[10]；双夏汤水洗液对小鼠有明显的镇静催眠作用[11]。本研究进一步观察了双夏汤对肝郁型失眠模型大鼠的镇静催眠作用及相关机制，旨在为其临床使用提供科学依据。

1 实验材料与方法

1.1药品与主要试剂 半夏、夏枯草购于安国东方药城中药材有限公司，经北京市药品检验所常增荣主任药师鉴定。安定(地西泮)，北京益民药业生产，批号：20131004；泻肝安神丸，北京同仁堂制药有限公司，批号：3082174；对氯苯丙氨酸(PCPA)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)及5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)标准品购自Sigma；戊巴比妥钠购自北京化学试剂公司，批号：020402。

1.2实验动物 Wistar雄性大鼠70只，体重180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。大鼠饲养于北京中医药大学中药药理系动物房，饲养温度23～26 ℃，12/12明暗交替，自由摄食、饮水，普通饲料喂养。

1.3实验仪器 YLS-1B多功能大鼠自主活动记录仪，山东省医学科学院设备站；动物运动轨迹跟踪系统Ethovision XT 9，Noldus；1525型高效液相色谱仪，Waters；ECD2465电化学检测器，Waters；Heraeus Fresco 21 高速冷冻离心机，Thermo；Labofuge 400R离心机，德国Heraeus；Atlantis C18色谱柱(2.1×150 mm，3 μm)，Waters，Lot 0149341601。

1.4方法

1.4.1双夏汤制备方法 半夏和夏枯草各等量用水煎煮得提取液，过滤、浓缩、过大孔树脂柱，用水洗脱，浓缩收集液即得。

1.4.2分组、造模及干预 大鼠适应性饲养后，按体重随机分为7组，每组10只。除正常组外，其余组均参照文献[12]造模：采用束缚法和夹尾激怒轮流安排，刺激时间为3周。束缚法将大鼠置于自制束缚器中，2 h/次，2次/d。夹尾刺激用尖端包裹纱布的止血钳夹鼠尾，令其与笼内其他大鼠厮打，30 min/次，2次/d。造模第17天时腹腔注射PCPA混悬液[将PCPA用弱碱性(pH 7～8)生理盐水配置成混悬液，加1%阿拉伯胶助溶]1 mL/100 g，350 mg/kg，1次/d，连续注射2 d。模型评判标准：第一次腹腔注射28～30 h后，动物出现昼夜节律消失，表明模型复制成功。造模第8天，安定组给予4.2 mg/kg安定灌胃，泻肝安神丸组给予1.4 g/kg泻肝安神丸灌胃，双夏汤高、中、低剂量组分别给予7 g生药/kg、3.5 g生药/kg、1.7 g生药/kg双夏汤灌胃，正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，均每天1次，连续2周。

1.5观察指标

1.5.1动物体征、体重、进食量 造模第7，14，21天观察各组大鼠皮毛、精神、行为等变化，记录体重和24 h内进食量。

1.5.2大鼠敞箱实验活动情况 敞箱底面为80 cm×80 cm正方形，划分为25个等格，箱高40 cm，以大鼠穿越底面块数(三爪均进入的方格方可计数)为水平得分(反映动物的活动度)，以直立次数(双足离开底面至放下为1次活动)为垂直得分(反映动物的好奇程度)，记录第7，14，21天各组大鼠活动水平得分、垂直得分。

1.5.3戊巴比妥钠诱导睡眠情况 末次灌胃30 min后，各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg，记录大鼠的入睡潜伏期和睡眠时间。睡眠判定标准：大鼠腹部朝上，翻正反射消失达1 min以上。

1.5.4脑内单胺类神经递质含量 行为学测定结束后，处死大鼠并快速取大脑皮质、下丘脑，-80 ℃冻存。采用高效液相色谱-电化学检测法测定大鼠皮质和下丘脑中NE、DA、5-HIAA、5-HT含量。测定时将冻存组织放在预冷的离心管中，皮质加入3倍体积、下丘脑加入5倍体积的高氯酸溶液，冰浴下电动匀浆机匀浆，静置10 min，4 ℃下12 000 r/min离心(离心半径为10.6 cm)10 min，吸取上清，再次离心，吸取上清，0.2 μm滤膜过滤，进样。液相条件：Atlantis C18色谱柱(2.1×150 mm，3 μm)；流动相：50 mmol/L柠檬酸-乙酸钠，内含1 mmol/L B8离子对试剂、4%甲醇、1.8 mmol/L 二正丁胺、0.3 mmol/L Na2EDTA、2 mmol/L 氯化钠。检测电压+0.75 V，流速0.3 mL/min，柱温35 ℃。

2 结 果

2.1各组大鼠体征、体重及进食量比较 正常组大鼠毛色干净顺滑、有光泽，身体灵活、有探索性，无攻击性或躲避行为，随着饲养时间的延长，大鼠的体重和进食量增加较快；模型组大鼠随造模时间的延长，逐渐出现毛色暗淡变糙无光泽、胡须下垂、易怒、探索性活动减少，体重和进食量均明显低于正常组(P均<0.05)；双夏汤各组大鼠较模型组大鼠毛色顺滑，探索性活动增加，体重和进食量增加，其中双夏汤高剂量组大鼠的体重、进食量在造模第21天时均明显高于同期模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠实验不同时间点体重及进食量比较

2.2各组大鼠在敞箱中活动情况比较 模型组大鼠造模第7，14，21天的水平运动和垂直运动得分均明显低于同期正常组(P均<0.05)；双夏汤中剂量组大鼠造模第14天和第21天水平运动和垂直运动得分均明显高于同期模型组(P均<0.05)，双夏汤低剂量组大鼠造模第21天水平运动和垂直运动得分也均明显高于模型组(P均<0.05)，安定组、泻肝安神丸组、双夏汤高剂量组大鼠水平运动和垂直运动得分与同期模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠在敞箱中活动情况比较 分)

2.3各组大鼠对戊巴比妥钠诱导睡眠情况比较模型组大鼠入睡潜伏期明显长于正常组(P<0.05)；各药物组大鼠的入睡潜伏期均明显短于模型组(P均<0.05)；安定组和双夏汤高剂量组大鼠睡眠时间均明显长于模型组(P均<0.05)，其余组大鼠睡眠时间虽有延长，但与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠对戊巴比妥钠诱导的睡眠情况比较

2.4各组大鼠脑内单胺类神经递质含量比较 大脑皮质中，模型组大鼠NE、DA、5-HIA、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA均明显低于正常组(P均<0.05)，各给药组大鼠各指标与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。下丘脑中，模型组大鼠DA、5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA均明显低于正常组(P均<0.05)；泻肝安神丸组大鼠5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA，双夏汤高剂量组和双夏汤低剂量组NE、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA，双夏汤中剂量组5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE均明显高于模型组(P均<0.05)。见表4及表5。

表5 各组大鼠下丘脑中单胺类神经递质含量比较

表4 各组大鼠大脑皮质中单胺类神经递质含量比较

3 讨 论

肝气郁结多与情志有关，而失眠多与情志疾病伴行，二者相互影响。《辨证录·不寐门》中说：“气郁既久，则肝气不舒，肝气不舒，则肝血必耗，肝血既耗，则木中之血不能润于心，则不寐。”临床资料研究显示，肝郁气滞型失眠具有睡眠潜伏期长，总睡眠时间少，睡眠效率低，觉醒次数多等特点[13]。根据临床流行病学影响因素调查显示，约60%的患者为肝郁因素引发失眠症状，其中46%的肝郁失眠患者是由急躁易怒等不良情绪引发[14]。“怒伤肝，久则郁”，在情志致病中以急躁恼怒伤肝最为常见。

本研究采用夹尾激怒法和束缚法轮流刺激3周结合PCPA复制肝郁型失眠大鼠模型，大鼠体征及行为活动随造模时间延长而逐渐表现为皮毛粗糙无光泽、情绪低下、活动减少、探索性降低、蜷缩角落、易怒，有攻击行为或躲避行为，体重和进食量明显降低，戊巴比妥钠诱导入睡潜伏期延长，睡眠时间缩短，与肝郁证常见的缺乏活力、沉默寡言、生活兴趣减退等临床表现类似。

既往研究显示，夏枯草水提物、等比例半夏和夏枯草水煎煮制备的合剂均能明显缩短小鼠悬尾不动时间和强迫游泳不动时间，有抗抑郁作用，与半夏和夏枯草配伍具有疏肝解郁、化痰理气功效有关[15-16]。此外，半夏得阴而生，引阳入阴，夏枯草并纯阳之气，得阴而枯，二者配伍可以交通阴阳，契合失眠的阳不入阴、阴阳失调的病机，具有明显改善失眠的作用[17]。本实验结果显示，造模第21天，双夏汤高剂量组大鼠的体重、进食量和双夏汤中、低剂量组大鼠的水平运动和垂直运动得分均明显高于同期模型组，双夏汤各剂量组大鼠的入睡潜伏期均明显短于模型组，双夏汤高剂量组大鼠睡眠时间明显长于模型组。提示双夏汤可明显提高肝郁型失眠大鼠活动度和探索性，有改善肝郁症状和镇静催眠作用。

脑内单胺类神经递质是调节机体情绪、行为状态、精神活动的重要物质。NE、5-HT含量降低与抑郁有关，5-HT、NE、DA是调节“觉醒-睡眠”周期的重要成分。DA和NE参与维持觉醒状态，而5-HT能延长非快速眼动睡眠时间，与抑制觉醒有关，NE具有一定的拮抗5-HT维持睡眠状态的作用[18]。PCPA为一种色氨酸羟化酶抑制剂，腹腔注射可以减少大鼠体内5-HT的合成，降低脑内和血液中的5-HT含量，导致大鼠昼夜节律消失，白天活动增加，是诱导大鼠失眠的常用模型。有研究显示，PCPA诱导大鼠失眠模型中，不仅影响5-HT的合成，也会导致中缝背核和尾状壳核NA和DA含量降低[19]。本实验结果显示，夹尾激怒法和束缚法轮流刺激3周叠加PCPA诱导的肝郁型失眠大鼠皮质和下丘脑中DA、5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA明显降低，双夏汤各剂量组各指标与模型组比较均无明显变化；双夏汤高剂量组和双夏汤低剂量组大鼠下丘脑中NE、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA，双夏汤中剂量组大鼠下丘脑中5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE均明显高于模型组。提示双夏汤对肝郁型失眠大鼠大脑皮质中神经递质无明显影响，对下丘脑中神经递质有影响，由于下丘脑是睡眠和昼夜节律调控的重要区域，推测双夏汤可能是通过调节下丘脑中单胺类神经递质稳态而改善肝郁型失眠的。

综上所述，双夏汤可改善肝郁型失眠，其可能是通过调节脑内单胺类神经递质稳态，尤其是增加5-HT含量发挥作用，为双夏汤临床治疗肝郁型失眠提供了实验依据，后续还需借助脑电监测和分子生物学技术，通过分析睡眠-觉醒周期和分子变化，进一步确定其治疗肝郁型失眠的作用和作用机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。