基于一流课程建设思维的蛋白质相关系列性综合性实验教学内容的设计与教学实践

赵鲁杭，邹 玲，翁登坡，廖志银，于晓虹，霍朝霞

(浙江大学医学院，浙江 杭州 310058)

实验教学作为现代大学发展水平的标志，是一流本科课程建设的重要内容，一流本科实验教学课程建设的标准要具有“两性一度”的特性，即提升高阶性、突出创新性、增加挑战度[1]，主要体现在实验课程教学项目内容的广度和深度、实验教学方式和手段(认知模式)的多样性以及教学内容综合性、先进性、创新性等方面，所以做好实验教学项目内容的规划和设计是非常重要的[2]。一流本科课程建设不仅仅体现在1～2个具体的实验教学内容上，而应体现在整个课程教学内容的设计理念上。

蛋白质是生命的物质基础，高校“生物化学”或“生物化学与分子生物学”等实验课程都会涉及与蛋白质相关的实验教学内容，主要内容范围包括：蛋白质的提取、含量测定、分离鉴定、分子量测定、分离纯化、活性检测或功能分析以及蛋白质(基因)表达的检测等，不同的高校会根据各自的实验教学条件、实验教学大纲的规划和要求安排相关的实验教学内容[3-5]。从多个院校的实验教材和教学计划上看，这些实验教学内容多是相互独立的实验项目，缺乏相互的关联性，而且当代先进实验技术和方法的相关内容未完全落实在学生的实验课程学习范围内，这与教育部对新时代高等学校本科教育的要求是不相符合的[6]。我们在2018级～2020级的《分子医学实验》《生物化学与分子生物学实验》等实验课程的教学实践中，将蛋白质相关的实验教学内容整合成相互关联的系列性、综合性实验教学内容体系，并在本科生的实验教学内容中利用线上实验教学资源，引入了当代先进实验技术和方法的实验教学内容，环环相扣，拓展了学生的学习空间和视野，培养了学生解决复杂问题的综合能力、高级思维能力和自主创新性能力，取得了良好的实验教学效果，受益的本校学生人数达2 700人。

1 蛋白质相关系列实验的设计框架

《分子医学实验》《生物化学与分子生物学实验》等实验课程中蛋白质相关实验教学内容主要包括四个单元(图1)：①组织细胞蛋白质的提取及含量测定；②SDS-PAGE分离蛋白质及特定蛋白质的相对分子质量测定；③基因表达的检测；④各种分离纯化蛋白质的层析技术和方法。这些看似相互独立的实验项目和内容，实际上是一个相互关联的系列性、综合性实验项目，将蛋白质提取与含量测定、分离与相对分子量的测定、基因表达的检测以及蛋白质分离纯化技术方法等实验安排在四个不同教学时间单元中完成，但彼此之间是相互关联，前一个实验为后续的实验提供实验材料，环环相扣。

图1 蛋白质相关系列性、综合性实验教学内容

1.1 组织细胞蛋白质的提取及含量测定

组织细胞中总蛋白质的提取几乎是所有蛋白质相关系列实验的第一步，通过教学讲解学习各种不同生物来源的组织细胞破碎方法和蛋白质提取方法上的差异，并进行组织蛋白质的提取。本实验用细胞匀浆器破碎小鼠肝脏组织细胞提取总蛋白，经离心获得的上清液为蛋白质粗提液，分别用三种不同的实验方法进行蛋白质的含量测定，学习和掌握不同的蛋白质含量测定方法的原理和灵敏度的差异，并将检测的结果进行比较和分析。实验结果表明同一种蛋白质粗提液样本利用不同的方法进行含量测定，所得到的实验结果都是不一样的，使学生了解和掌握多数蛋白质含量测定的方法所测定的都是蛋白质的相对含量，是相对于标准蛋白质样本而言的，而非绝对含量。本次实验中提取的蛋白质一部分用于当天蛋白质含量测定的实验材料，另一部分作为后续实验材料置-20℃低温冰箱分装保存。

1.2 SDS-PAGE分离蛋白质及特定蛋白质的相对分子质量测定

在第二单元的实验中，以上一单元提取的蛋白质样本为实验材料，每个实验小组制备两块SDS-PAGE凝胶，两块胶以同样的方式加样并进行SDS-PAGE，电泳结束后将其中的一块胶进行考马斯亮蓝染色观察提取蛋白质样本的分离情况，并测定牛血清白蛋白的相对分子质量(见图2)，另一块胶做转膜处理后4℃冰箱保存，用于第三单元的Western blot实验。

图2 SDS-PAGE结果图(A：标准分子量蛋白质Marker，B：样本1，C：样本2，D：牛血清白蛋白)

本单元实验除了学习SDS-PAGE分离组织细胞蛋白质提取物的实验技术外，还将学习利用标准分子量蛋白质Maker的分子量与电泳相对迁移率的函数关系制作标准曲线，测定牛血清白蛋白的分子量，并通过转膜实验将蛋白质转移到PVDF膜上，作为第三单元Western blot实验的材料。

1.3 基因表达的检测

基因表达涉及DNA转录生成mRNA和mRNA翻译生成蛋白质两个主要过程，检测基因表达变化的实验技术和方法比较多，分别可以从mRNA水平上和蛋白质水平上对基因的表达进行检测，这些实验技术较为先进，体现了学科发展的前沿[7-8]。由于有些实验耗时长，所要求的仪器设备复杂、昂贵，试剂消耗费用大等，所以无论是实验时间上，还是在实验设备和经费条件上都不可能将所有的实验面向本科学生进行开设。本单元线下进行Western blot实验，将上一单元转膜处理的PVDF膜依次进行脱脂奶粉封闭、一抗反应、二抗反应、化学发光检测等过程，检测提取的蛋白质样本中3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH，MW 37KD)表达情况(见图3)。线上利用虚拟仿真实验和教学视频等方式学习其他的基因表达检测方法，包括：RT-PCR技术检测mRNA表达、二维电泳实验技术和蛋白质组学研究实验技术检测组织细胞内蛋白质表达的整体差异和变化、流式细胞术检测细胞表面或细胞内蛋白质的表达等。

图3 蛋白质提取液中GAPDH的Western blot实验结果(A：标准分子量蛋白质Marker，B：样本1 GAPDH 化学发光检测结果，C：样本2 GAPDH 化学发光检测结果)

1.4 各种层析技术分离纯化蛋白质

层析技术是化学物质分离、纯化最常用的方法，其中蛋白质的分离纯化也常用到各种层析技术和方法，如凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等[9]。由于课堂线下实验教学的时间有限，而蛋白质层析分离纯化过程往往需要较长的时间，所以在实际实施过程中有些实验可以降低一点实验的复杂程度，重点放在学生学习实验技术和方法上。如凝胶层析法分离血红蛋白(红色，分子量64 500)和DNP-鱼精蛋白(黄色，分子量2 000-12 000)混合物(实验)，由于分子量的不同，混合物在层析分离过程中会形成红色和黄色的区带，通过肉眼就可以观察到实验的结果。在常规常压层析实验的基础上，引入大型仪器高效(压)液相层析(HPLC)的演示性教学，使学生有机会学习和了解先进仪器设备在相关实验研究中的应用，并通过同一实验样品用常压液相层析和HPLC的分离效果的比较了解不同实验技术方法的特点和优势所在(图4A、图4B)。常压液相凝胶过滤层析两个蛋白峰之间未能做到基线分离，分离效果较差，分离所需时间较长，分离时间约70分钟；凝胶过滤HPLC两个蛋白峰之间实现了基线分离，分离效果和重复性好，分离所需时间较短，10分钟即可完成样本的分离纯化过程。

图4A 常压液相凝胶过滤层析

图4B 凝胶过滤HPLC

2 多种教学模式实现先进实验技术教学内容的学习

新时代高等学校本科教育的目的是培养有知识、能力、素质和觉悟的新型建设性人才，培养学生解决复杂问题的综合能力和高级思维能力[10]。建设一流本科课程需要突破学生的习惯性思维和认知模式，通过多种实验教学模式，实现具有前沿性、时代性的先进实验技术教学内容的学习，体现实验课程的先进性和高阶性。

在基因表达的检测这个单元的实验教学中，由于涉及的实验教学内容较多，而且很多都是较为前沿的实验技术[11-12]，我们在线下安排学生完成蛋白质印迹实验的基础上，还安排了多个线上实验教学内容，并在部分教学资源缺乏的情况下，自主开发了“定量蛋白质组学研究虚拟仿真实验教学软件”和“流式细胞术细胞分型虚拟仿真实验教学软件”，将线上学习的成绩计入实验课程的总成绩。蛋白质组学研究是后基因组时代的重要研究内容之一，也是整个生命科学领域应用非常广泛的先进实验技术和方法，可以一次性比较多种不同生物样本中表达的所有蛋白质的质和量的变化和差异[13-14]。但是因为该技术需要使用一些大型的仪器设备(色谱仪、液质联用仪)、实验过程耗时长、实验试剂昂贵等原因，在本科生的实验中是不可能开展此实验项目[15]。在国内率先将蛋白质组学研究实验技术应用于本科生的实验教学中，“定量蛋白质组学研究虚拟仿真实验”利用现代数字信息技术，通过虚拟的实验场景和虚拟的操作过程，完成了临床真实案例引导的虚拟实验研究(PBL实验教学模式)，并对真实的实验结果进行了分析，将先进的基础研究实验技术与解决临床问题相结合，虚实结合，解决了一流实验课程教学内容中非常有必要，但现实实验教学中却难以开展的实验教学项目。

HPLC是在高压的状态下进行层析的一种实验方法，与常压层析实验相比具有分离速度快、分辨率高、实验重复性好等特点，但由于HPLC仪是一种大型的精密仪器，实验前准备和维护保养的要求较高，所以利用教学演示的方法对混合蛋白质样本进行HPLC分离检测，并将实验结果与常压状态下的层析实验进行对比(图4A、图4B)，这样学生不但可以学习HPLC的工作原理，也能更好地了解HPLC的技术特点和优势。

3 结语

将一个完整的蛋白质提取、含量测定、分离鉴定、分子量测定、分离纯化、活性检测或功能分析以及蛋白质(基因)表达的检测等生化大实验设计成4个系列性、综合性实验，实验与实验之间教学内容环环相扣，可以让学生理解和掌握每个实验的相对独立性以及实验之间的相互关联性，培养了学生的整体观，这样既可以解决长时段实验时间安排困难的问题，又能解决学生知识学习的完整性问题。线上线下混合式教学方式拓展了学生的学习空间，解决了现实实验条件下难以完成的先进实验技术的学习和体验的问题，强化了现代信息技术与教育教学的深度融合，解决了教学模式创新的问题。基于临床科学问题的PBL教学模式将先进的实验技术与临床研究相结合，培养了学生的科研能力和创新性思维能力。线上学习成绩纳入整个课程的考核评价体系，结合整个实验课程后续的自主探究性、创新性实验部分，提升了课程学习的广度和深度，增加了课程学习的难度和挑战性。