D-氨基半乳糖糖基化修饰玉米肽抗疲劳效应的研究

夏春荣 王晓杰 姜宇航 曲 悦 刘晓兰

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，齐齐哈尔 161006)

疲劳是在同等工作强度下工作一段时间后机体的工作能力下降、能量供应不足的一种状态[1]。当人体处于疲劳状态时，如果不及时恢复，逐渐积累，则可能会导致机体内分泌失调、免疫力下降，甚至会诱发疾病[2]。因此，有必要对天然抗疲劳的活性物质进行研究，在不产生不利影响的前提下，改善人类的运动能力，以推迟疲劳并加速消除疲劳[3]。目前，一些疲劳产生的机制学说包括“能量耗竭学说”“代谢产物堆积学说”“自由基学说”等[4]。其中，“自由基学说”近年来引起了越来越广泛的关注。该学说认为在剧烈运动时，体内自由基生成、脂质过氧化等过程会加速，造成自由基堆积，从而产生更多的氧化活性物质。这些氧化活性物质会加速疲劳的产生，减弱机体的运动能力[5]。因此，增强机体抗氧化能力可缓解疲劳的产生，并保护机体免受氧化活性物质的伤害。

玉米肽是玉米蛋白经蛋白酶水解或微生物发酵后获得的低分子量产物。玉米蛋白富含疏水性氨基酸，使玉米肽具有很强的抗氧化活性，通过清除自由基消除疲劳[6,7]。玉米糖肽是在转谷氨酰胺酶催化下，氨基糖与玉米肽共价结合的产物。由于氨基糖的共价结合使玉米肽的功能性质得到显著提高，如抗氧化活性等[8]。因此，推测玉米糖肽也具有较强的抗疲劳功能。但是，目前鲜有研究关注玉米糖肽的抗疲劳活性。本实验以D-氨基半乳糖糖基化修饰的玉米肽原料，利用ICR小鼠疲劳模型，通过负重游泳实验、转棒实验及与疲劳相关生化指标的检测，研究玉米糖肽的抗疲劳效应，为玉米糖肽在食品工业中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

D-氨基半乳糖：色谱级；碱性蛋白酶Alcalase、转谷氨酰胺酶(1 000 u/g)：食品级；乳酸脱氢酶试剂盒、乳酸试剂盒、肝/肌糖原试剂盒、尿素氮试剂盒、总超氧化物歧化酶试剂盒、还原型谷胱甘肽试剂盒和丙二醛试剂盒；其他试剂均为分析纯。ICR小鼠、标准颗粒鼠粮。

1.1.2 主要仪器设备

DF-I集热式磁力加热搅拌器，DU800紫外可见分光光度计，ZB-200疲劳转棒仪，TSE991超低温冰箱，TDL-5-A离心机，ZH游泳箱。

1.2 方法

1.2.1 玉米肽的制备

称取40 g玉米醇溶蛋白，配成底物浓度5%的悬浮液，将烧杯放入60 ℃水浴进行磁力搅拌，调节pH至8.5后加入1.2 g碱性蛋白酶Alcalase，开始酶解反应，酶解过程中通过不断滴加1 mol/L NaOH使pH维持在8.5，酶解2.0 h后取出立即放入沸水浴中灭酶15 min，冷却至室温后获得玉米肽。

1.2.2 玉米糖肽的制备

向制备的玉米肽中添加D-氨基半乳糖12.61 g，保证反应体系中蛋白质酰基供体与D-氨基半乳糖酰基受体摩尔比为1∶1。调节pH至8.0后加入2.4 g转谷氨酰胺酶，封膜放入44 ℃恒温水浴振荡器中，开始糖基化反应。7 h后，反应液冷却至室温，4 000 r/min离心15 min，取上清液过截断分子量300 u的纳滤膜，除去反应体系中未反应的D-氨基半乳糖和多余的盐分，将浓缩液放入超低温冰箱中冻结，冷冻干燥48 h后获得玉米糖肽。

1.2.3 ICR小鼠的饲养

选用4～6周龄、18～22 g的雄性ICR小鼠，饲养于阴凉通风、相对湿度50%～60%、室温(25±2) ℃的实验动物清洁室，每天保证12 h光照和12 h黑暗，饲养期间小鼠自由进食和饮水。实验过程符合动物实验伦理要求，并尽可能将实验动物的痛苦降至最低。

1.2.4 实验分组与玉米糖肽使用剂量

雄性ICR小鼠108只，驯化1周后，进行游泳筛选实验，将放入水中呛水沉底的不会游泳或游泳姿势不协调的小鼠剔除。将符合条件的小鼠随机分为6组，每组18只，分别为正常组、模型组、玉米糖肽低剂量组(125 mg/kg bw，简称糖肽-125)、中剂量组(250 mg/kg bw，简称糖肽-250)、高剂量组(500 mg/kg bw，简称糖肽-500)和阳性对照组(玉米肽，500 mg/kg bw，简称玉米肽-500)。玉米肽和三个玉米糖肽剂量组在灌胃前，先将玉米肽配成浓度为500 mg/10 mL的溶液，玉米糖肽配成浓度分别为125、250、500 mg/10 mL的溶液，按每10 g 体重给药0.1 mL进行灌胃。每天称重后按体重调整玉米肽和玉米糖肽溶液的灌胃体积以保证相应的灌胃剂量。正常组和模型组给予生理盐水，灌胃周期为28 d。

1.2.5 抗疲劳指标的检测

1.2.5.1 转棒实验

末次给予玉米糖肽和玉米肽30 min后，依次将各组小鼠放在转棒上，调节转棒的速度为25 r/min，记录各组小鼠由于肌肉疲劳从转棒上跌下的时间，前3次为预实验，从第4次开始计时，小鼠从转棒上跌落的时间记为小鼠转棒时间。如果小鼠30 min未从转棒上跌落，则其转棒时间记为30 min。

1.2.5.2 负重游泳实验

末次给予玉米糖肽和玉米肽30 min后，给小鼠负体重10%的铅块，将小鼠放于水深不少于25 cm、水温25 ℃的游泳箱中，记录自游泳开始至头部全部沉入水中8 s不能浮出水面的时间，作为小鼠的负重游泳时间。

1.2.5.3 疲劳相关生化指标的测定

末次给予玉米糖肽和玉米肽30 min后，将小鼠放于水温25 ℃的游泳箱中游泳30 min，休息60 min后取血和肝脏。血液分离出血清，肝脏用冰预冷的生理盐水制成10%肝匀浆液，3 000 r/min 离心10 min，取上清液用于生化指标的测定。

1.2.6 数据处理

所有数据均以平均值±标准差表示，用SPSS Statistics 19.0进行统计学分析。采用Duncan检验进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著性水平。

2 结果与讨论

2.1 玉米糖肽对小鼠体重的影响

连续灌胃28 d，玉米糖肽对小鼠体重的影响如图1所示。

图1 玉米糖肽对小鼠体重的影响

在实验期间内，所有处理组的小鼠均稳定生长，玉米肽-500、糖肽-125、糖肽-250和糖肽-500组的体重增加量分别为(6.53±1.52)、(6.95±1.00)、(6.26±1.14)、(6.14±1.01)g，与正常组(7.59±0.93)g相比差异不显著(P>0.05)。由于体重被认为是健康的指标[9]，处理组和正常组的体重增长趋势相似，表明在实验浓度下，玉米肽和玉米糖肽安全无毒，对小鼠的健康没有产生不利影响。

2.2 玉米糖肽对小鼠转棒和负重游泳时间的影响

运动耐力的下降是疲劳最直接的表现，转棒时间和力竭游泳时间是反映运动耐力的重要指标[10]，在运动营养研究领域中常被用于评价抗疲劳的效果。测定小鼠转棒时间和负重游泳时间以表征玉米糖肽对小鼠运动耐力的影响，实验结果如表1所示。

表1 玉米糖肽对小鼠转棒和负重游泳时间的影响

与正常组相比，玉米肽组和三个玉米糖肽剂量组小鼠的转棒时间均增加，尤其是玉米糖肽中、高剂量组，小鼠的转棒时间显著增加(P<0.05)，分别是正常组的2.96倍和3.80倍；与正常组相比，玉米糖肽低、中、高剂量组小鼠的负重游泳时间均增加，尤其是糖肽-500组，小鼠的负重游泳时间是正常组的1.76倍，说明玉米糖肽的摄入增加了小鼠的运动耐力，原因可能是玉米糖肽易于吸收利用，可以直接向肌肉供能，提高了小鼠体内的有氧代谢能力，减轻了由运动产生的生理变化，达到了抗疲劳作用；而玉米糖肽的效果优于玉米肽，可能是因为除寡肽以外，糖基化修饰产物中共价结合的糖基也可以为机体提供能量，进而提高了小鼠的运动耐力。

2.3 玉米糖肽对疲劳相关生化指标的影响

2.3.1 玉米糖肽对小鼠血清尿素氮含量的影响

血清尿素氮是蛋白质和氨基酸的代谢产物[11]。当身体能量供应不足时，由于运动疲劳，蛋白质将被消耗，血清尿素氮水平将增加[12]。 因此，血清尿素氮含量与运动耐量之间存在负相关。玉米糖肽对小鼠血清尿素氮含量的影响如图2所示。与正常组相比，模型组的血清尿素氮含量极显著增加(P<0.01)，增加了33.77%，提示在持续游泳30 min后，小鼠体内糖与脂肪供能不足，蛋白质参与提供能量，出现运动疲劳。与模型组相比，玉米糖肽低、中、高剂量组小鼠的血清尿素氮含量分别降低6.73%、14.36%、15.94%，且高剂量组的血清尿素氮含量相对于玉米肽-500下降了7.03%，这说明在剧烈运动过程中，玉米糖肽可以显著降低小鼠肌肉蛋白质的分解代谢，原因可能是玉米糖肽中含有大量的功能性短肽的同时还含有糖基，肽和糖基均可以参与糖代谢的调节，减少了肌肉蛋白质的消耗，进而减少血清尿素氮的产生。

注：##为与正常组相比差异极显著性(P<0.01)；*为与模型组相比差异显著性(P<0.05)；**为与模型组相比差异极显著性(P<0.01)，下同。图2 玉米糖肽对血清尿素氮含量的影响

2.3.2 玉米糖肽对小鼠血清乳酸含量的影响

血乳酸是在无氧条件下碳水化合物的糖酵解产物，而糖酵解是短时间内进行剧烈运动的主要能源。因此，血乳酸含量是判断疲劳程度的重要指标之一[13]。玉米糖肽对小鼠血清中乳酸含量的影响如图3所示。与正常组相比，模型组的血清乳酸含量极显著增加(P<0.01)，增加了45.64%，说明剧烈运动使葡萄糖经无氧酵解产生乳酸，这部分乳酸不能在短时间内进一步分解成水和二氧化碳，导致大量的乳酸堆积，使小鼠出现运动疲劳状态。与模型组相比，玉米糖肽低、中、高剂量组小鼠的血清乳酸含量均极显著降低(P<0.01)，尤其是玉米糖肽中、高剂量组，血清乳酸含量恢复到正常水平。与模型组相比，玉米糖肽低、中、高剂量组的血清乳酸含量分别下降21.79%、23.57%、25.35%，且糖肽-500组的乳酸含量相对于玉米肽-500组降低了14.57%，说明玉米糖肽通过提高小鼠体内的有氧代谢能力而减少乳酸的形成，增加了运动负荷的适应能力，达到有效缓解疲劳的目的。

注：^为与正常组相比差异不显著(P>0.05)，下同。图3 玉米糖肽对血清乳酸含量的影响

2.3.3 玉米糖肽对血清乳酸脱氢酶活力的影响

乳酸脱氢酶被称为肌肉活动的准确指标，血清中水平升高表明已经发生肌肉损伤[14]。玉米糖肽对小鼠血清中乳酸脱氢酶活力的影响如图4所示。

注：#为与正常组相比差异显著(P<0.05)，下同。图4 玉米糖肽对血清乳酸脱氢酶活力的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清乳酸脱氢酶活力显著升高(P<0.05)，说明剧烈运动后小鼠肌细胞膜的通透性增加，肌肉酶溢出，导致乳酸脱氢酶在血清中的浓度升高。与模型组相比，糖肽-500组使乳酸脱氢酶活力显著降低(P<0.05)，降低了21.39%，分析可能与玉米糖肽富含支链氨基酸有关。人体体外实验已经证实，运动后补充支链氨基酸(BCAA，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、苯丙氨酸等必需氨基酸可以缓解运动导致的骨骼肌蛋白质水解，促进肌肉蛋白质的合成代谢，进而积极有效地修复了骨骼肌的损伤[15,16]。玉米糖肽和玉米肽的氨基酸组成相似，且含有更多的支链氨基酸[8]。因此，糖肽-500修复骨骼肌损伤的能力优于玉米肽-500。

2.3.4 玉米糖肽对小鼠肌糖原和肝糖原含量的影响

能量消耗和缺乏会导致运动过程中的身体疲劳，如果能量耗尽，人体的耐力就会明显下降。运动所需的能量最初源自糖原分解，剧烈运动后，血糖含量下降，肌糖原首先会被消耗，此后机体会分解肝糖原为代谢提供能量。玉米糖肽对小鼠肌糖原及肝糖原含量的影响如图5所示。

由图5a可见，与正常组相比，模型组的肌糖原含量极显著降低，降低了31.31%，说明剧烈运动中大量的血糖被消耗时，肌糖原被分解供能。与模型组相比，实验剂量的玉米肽不能抑制肌糖原的减少，而随着玉米糖肽剂量的增加，肌糖原含量逐渐增加至正常水平，玉米糖肽低、中、高剂量组的肌糖原含量分别增加10.29%、39.71%和44.12%，说明玉米糖肽可以在运动过程中提供能量，以防止在运动过程中能量的消耗，这与Nikawa等[17]的研究结论相一致。

从图5b可知，与正常组相比，模型组的肝糖原含量极显著降低，降低了81.56%，说明剧烈运动中肌糖原消耗的同时肝糖原也会被分解为葡萄糖来维持机体血糖水平，以满足运动需求。与模型组相比，玉米肽组和中、高剂量玉米糖肽组的肝糖原含量均极显著增加(P<0.01)，并且与正常组相比差异不显著(P>0.05)。糖原是机体运动的主要贮能物质，糖原的过量消耗是机体运动能力减弱的主要原因，摄入玉米肽和玉米糖肽后肝糖原含量增加，可能是玉米糖肽通过提升肝、肌糖原储备或通过减少运动过程中糖原的消耗或两者同时存在，延迟了小鼠肝脏和肌肉糖原的消耗，进而延缓疲劳产生，提高了小鼠的运动耐力。You等[2]发现泥鳅蛋白水解物通过延迟肝脏糖原的消耗而具有抗疲劳的作用。

图5 玉米糖肽对小鼠肌糖原和肝糖原含量的影响

2.3.5 玉米糖肽对小鼠肝脏氧化应激状态的影响

大量的人体和动物实验证明，力竭性运动可使机体内产生大量自由基，脂质过氧化程度增强，导致运动性疲劳的产生甚至诱发疾病[19,29]。检测玉米糖肽对小鼠肝脏超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽和丙二醛含量的影响，以表征玉米糖肽对疲劳导致的肝脏氧化应激状态的影响，实验结果如表2所示。

表2 玉米糖肽对小鼠肝脏超氧化物歧化酶活力以及谷胱甘肽和丙二醛含量的影响

与正常组相比，模型组的超氧化物歧化酶活力极显著降低(P<0.01)，降低了43.22%，说明经过剧烈运动后，小鼠体内自由基的产生速率大于清除速率，超氧阴离子自由基对机体组织细胞产生损害，运动能力受到影响。与模型组相比，玉米肽组和三个玉米糖肽组的超氧化物歧化酶活力均极显著增加至正常水平，其中，玉米肽-500组的超氧化物歧化酶活力增加72.01%，玉米糖肽低、中、高剂量组的超氧化物歧化酶活力分别增加了46.11%、62.35%、76.51%。玉米糖肽的摄入比玉米肽更能缓解运动疲劳给机体带来的氧化性损伤，可能是因为糖基化修饰使玉米肽具有更强的抗氧化能力[8]，加速体内超氧阴离子自由基的清除，拮抗了骨骼肌在强烈收缩过程当中不断生成的活性氧簇对超氧化物歧化酶的损耗，提升了小鼠的运动表现。这与王耀东等研究结果相一致[18]。

与正常组相比，模型组的谷胱甘肽含量极显著降低(P<0.01)，降低了2.98倍，说明小鼠过度运动后产生了大量的氧自由基，导致机体内产生氧化应激。与模型组相比，玉米肽-500组的谷胱甘肽含量降低5.75%，而随着玉米糖肽浓度的增加，尤其是糖肽-500组，谷胱甘肽含量显著增加(P<0.05)，说明摄入高剂量玉米糖肽具有显著的抗氧化效果，可以从清除过氧化氢的角度缓解疲劳的产生。

与正常组相比，模型组丙二醛含量增加42.56%，说明小鼠过量运动后，产生了大量的自由基，导致脂质过氧化作用增强，生物膜的正常结构与机能遭到破坏，释放出丙二醛。与模型组相比，玉米肽组的丙二醛含量降低了23.54%，而低、中、高剂量玉米糖肽组的丙二醛含量分别降低19.17%、20.39%、26.21%。可能是因为玉米糖肽具有良好的抗氧化活性，能够清除或阻断自由基的链式反应，减少丙二醛的产生，从而对抗运动对心脏和骨骼肌造成的脂质过氧化损伤，起到抗疲劳的作用。

3 结论

研究D-氨基半乳糖酶法糖基化修饰玉米肽的抗疲劳效应，发现剂量为500 mg/kg bw的玉米糖肽能够显著延长实验小鼠的力竭游泳时间和转棒时间，减少实验小鼠激烈运动时肝糖原和肌糖原的消耗以及乳酸的产生与沉积，改善实验小鼠体内蛋白质的分解代谢及有效清除血清尿素氮，提高实验小鼠肝脏中SOD活力及GSH含量，增强机体清除自由基的能力，改善小鼠的运动耐力，确保小鼠在激烈运动状态下机体处于有氧运动模式，从而降低激烈运动后机体的疲劳程度，具有显著的抗疲劳效果。