桦木酸对T-2毒素诱导小鼠肝损伤的保护作用

杨成林，黄 超，刘 娟，黄卫梅，袁志航，易金娥,2，梁曾恩妮，邬 静,2,*

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2.畜禽保健湖南省工程研究中心，湖南 长沙 410128；3.湖南省农产品加工研究所，湖南 长沙 410125）

霉菌毒素是由霉菌产生的有毒次级代谢产物，根据产生霉菌的不同又分为曲霉菌属毒素、镰刀菌属毒素、青霉菌属毒素等。自然界中，霉菌毒素能够污染多种农作物及农产品，进而对人类健康和动物福利造成诸多危害[1]。T-2毒素属于镰刀菌属中毒性最强的A型单端孢酶烯族真菌毒素，可通过口腔、肠道、皮肤等途径进入机体，造成人体免疫系统、消化系统、神经系统、生殖系统等多种系统受损，导致饮食中毒性白细胞缺乏症、大骨节病等[2]。同时，T-2毒素还可引起动物的慢性或急性中毒，表现为虚脱、恶心、腹痛、血便、休克等症状，最终引发生长迟缓、饲料排斥和胃肠道功能障碍等健康问题[3-4]。大量研究证实肝脏是T-2毒素在体内的靶器官之一，低剂量的T-2毒素即可降低抗氧化酶的活性，造成动物肝脏出现氧化应激，产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA），引发肝脏脂质过氧化，抑制肝脏蛋白质的合成，进而导致肝细胞凋亡，可见氧化应激在T-2毒素引发的肝脏损伤过程中起着关键作用[5-7]。

桦木酸（betulinic acid，BA）是一种天然的五环三萜类化合物，广泛存在于以桦属植物白桦为主的多种植物和水果中，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗氧化等多种药理作用[8-10]。前期研究已证明BA能够缓解酒精诱导的肝损伤，调节谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、血清总胆固醇和甘油三酯水平，升高抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，降低MDA含量[11]。BA能够清除地塞米松诱导胸腺细胞产生的ROS，减少细胞凋亡[12]。在脂多糖诱导的急性肝损伤中，BA预处理能够升高还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量和CAT活性，降低了MDA含量，表现出明显的抗氧化活性[13]。因此推测BA可借助其抗氧化作用成为T-2毒素的潜在解毒剂。此外，鉴于Janus激酶/信号传导与转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路在氧化应激介导的细胞凋亡中所发挥的重要作用[14]，本研究以JAK/STAT信号为切入点，探讨天然产物BA对T-2毒素所致肝损伤的保护作用及其作用机理，为将BA开发为T-2毒素天然解毒剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

60 只4～5 周龄SPF级健康雄性昆明小鼠（生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004），饲料为M02小鼠普通饲料，均购于湖南斯莱克景达实验动物公司。

BA、VE 美国Sigma-Aldrich公司；T-2毒素 青岛普瑞邦生物工程有限公司。

ALP、AST、ALT、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulion，GLB）检测试剂 深圳迈瑞生物医疗电子有限公司； SOD、CAT、MDA、T-AOC、GSH检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；增强型化学发光液、TUNEL 试剂盒 江苏凯基生物技术股份有限公司；β-actin、JAK2、STAT3、Bax、Bcl-2、p-STAT3、p-JAK2、Caspase-3抗体 美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 仪器与设备

1.3 方法

1.3.1 实验分组与给药

60 只昆明小鼠适应性饲养1 周，自由采食和饮水， 温度21～25 ℃、相对湿度50%～70%。适应性饲养结束后，将60 只小鼠随机分为6 组，即空白对照组，T-2毒素组，BA低、中、高剂量组（0.25、0.5、 1 mg/kgmbBA+T-2毒素），VE干预组（100 mg/kgmbVE+ T-2毒素）。BA混悬于质量分数1%的可溶性淀粉溶液中，每天灌胃1 次，空白对照组和T-2毒素组仅灌胃质量分数1%的可溶性淀粉溶液，连续灌胃14 d。灌胃结束后，空白对照组小鼠按10 mL/kgmb腹腔注射体积分数75%乙醇溶液和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）混合液（体积比1∶12.5），其余5 组小鼠均腹腔注射T-2毒素（4 mg/kgmb）诱导肝损伤模型，15 h禁食不禁水处理，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后对小鼠进行眼眶采血和处死，解剖采集组织样本。

1.3.2 组织样本分离与保存

采集小鼠肝脏，拍照、称质量，切取肝左叶固定于体积分数4%中性甲醛溶液中，其余部分分装于-80 ℃保存备用。采集的血样放置于4 ℃保存过夜后，冷冻离心机3000 r/min离心10 min分离血清，分离的血清置于-80 ℃保存备用。

1.3.3 血清生化指标测定

采用检测试剂和全自动血液生化分析仪对血清中ALP、ALT、AST活力和TP、ALB、GLB质量浓度进行测定。

1.3.4 肝组织抗氧化能力测定

从及物动词的内部分类看，“买”是只能带体词性宾语(名词、代词、数量词)的动词；根据语义的主要特征和与之相关的语法特征，动词“买”属于动作动词中的弱持续动词；从动作行为是有意识的还是无意识的角度看，“买”属于自主动词，从语义上说它是能表示有意识的或有心的动作行为的动词，即“买”这个动作行为是能由动作发出者做主、主观决定、自由支配的动作行为。

取肝脏组织研磨、离心（4000 r/min、10 min），吸取上清液，严格遵循试剂盒使用说明，检测肝组织中T-AOC和CAT、SOD活力以及GSH、MDA含量。

1.3.5 肝脏组织病理学分析

取固定好的肝脏组织样本，用双蒸水冲洗，经乙醇脱水后嵌入石蜡，切成厚度5 µm的薄片并置于玻片上，二甲苯和不同体积分数乙醇脱蜡，苏木精和伊红染色，进行组织学观察。

1.3.6 TUNEL法检测细胞凋亡

用含有蛋白酶K（20 μg/mL）的PBS清洗石蜡切片，于37 ℃下孵育30 min，进行组织修复，再次用PBS冲洗3 次，随后添加破膜工作液，常温孵育20 min，PBS漂洗3 次，将试剂1（末端转移酶）和试剂2（异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP））按体积比2∶29的比例进行配制，组织避光孵育2 h，4’,6-二脒基-2-苯 基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）标记10 min，对细胞核染色，通过荧光显微镜观察。

1.3.7 Western blot法检测蛋白表达水平

取肝组织加入裂解液后研磨，收集上清液，使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，质量分数10%分离胶。 电泳结束转至聚偏二氟乙烯膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h，加入β-actin、Bax、Bcl-2、Caspsae-3、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2抗体孵育过夜，TBST冲洗3 次，每次10 min，加入二抗孵育1 h，TBST再次冲洗3 次，每次10 min，将聚偏二氟乙烯膜放置在凝胶成像仪暗室中，加入电化学发光试剂，使用Image软件对目的蛋白条带灰度值进行相对定量分析。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析，结果以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行差异显著性分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 BA预处理对T-2毒素致肝损伤小鼠肝脏外观的影响

图 1 BA预处理对T-2毒素诱导肝损伤小鼠肝脏外观的影响Fig. 1 Effect of BA pretreatment on liver appearance in mice with liver injury induced by T-2 toxin

如图1所示，空白对照组小鼠肝叶、肝边缘清晰，结构正常。与空白对照组相比，T-2毒素组小鼠肝脏颜色呈粉白色，质地坚硬，有黄白色奶酪状的坏死凸起。与T-2毒素组相比，BA预处理明显改善了肝脏的颜色、质地，颜色由粉白色逐渐恢复正常，坏死凸起数量逐渐减少，并呈现一定的剂量依赖性，肉眼观察BA高剂量组和阳性对照VE干预组小鼠肝脏外观没有明显差异。以上结果表明，BA预处理能够改善T-2毒素对肝脏的损伤作用。

2.2 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏病理学的影响

如图2所示，空白对照组中可见正常的肝索、肝窦结构，肝细胞索排列整齐，细胞形态正常，无炎症变化。与空白对照组相比，T-2毒素组肝组织正常结构消失，无明显的肝索、肝窦，并伴有炎性细胞浸润和细胞坏死。与T-2毒素组相比，BA预处理后，小鼠肝组织中肝索、肝窦等结构逐渐恢复，炎性细胞和坏死细胞数量明显减少，并呈现出一定的剂量依赖性。以上结果表明，T-2毒素能够诱导肝脏损伤，并造成肝结构紊乱、细胞坏死等病理变化，而BA预处理能够改善这些变化。

图 2 BA预处理对T-2毒素诱导小鼠肝脏病理变化的影响Fig. 2 Effect of BA pretreatment on pathological changes of liver tissues induced by T-2 toxin in mice

2.3 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏损伤血清生化指标的影响

ALP、ALT、AST活力是临床中检测肝损伤的重要指标，它们的异常变化表明肝脏受损。如图3所示，与空白对照组相比，T-2毒素组小鼠血清ALP、ALT、AST活力极显著升高（P＜0.01），血清TP质量浓度、ALB/GLB比值极显著降低（P＜0.01），表明T-2毒素导致肝损伤。与T-2毒素组相比，中、高剂量的BA预处理能够极显著降低血清ALT、AST活力（P＜0.01）；高剂量的BA预处理能够显著降低血清ALP活力和显著升高TP质量浓度 （P＜0.05）；各剂量BA预处理均能升高ALB/GLB比值，但与T-2毒素组无显著差异（P＞0.05）。以上结果表明，BA预处理能有效缓解T-2毒素引起的血清生化指标的异常变化，从而减轻肝损伤。

图 3 BA预处理对T-2毒素致肝损伤小鼠肝脏功能相关血清 生化指标的影响Fig. 3 Effect of BA pretreatment on serum biochemical indexes related to liver function in mice with liver injury caused by T-2 toxin

2.4 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏氧化损伤相关指标的影响

如图4所示，与空白对照组相比，T-2毒素处理极显著降低了小鼠肝组织中SOD、CAT、T-AOC以及GSH水平（P＜0.01），极显著升高了小鼠肝组织中MDA含量（P＜0.01），表明T-2毒素造成小鼠肝脏的氧化损伤。与T-2毒素组相比，中、高剂量BA预处理极显著升高了肝组织中T-AOC和SOD活力（P＜0.01）；高剂量BA预处理极显著升高肝组织中CAT活力（P＜0.01）；BA预处理极显著升高了肝组织中GSH含量，并极显著降低了MDA含量，呈剂量依赖性。以上结果表明，BA预处理能够通过增强机体的抗氧化酶活性降低MDA含量，从而保护肝脏免受T-2毒素造成的氧化损伤。

图 4 BA预处理对T-2毒素诱导小鼠肝脏氧化损伤相关指标的影响Fig. 4 Effect of BA pretreatment on oxidative damage indexes of liver tissues in mice induced by T-2 toxin

2.5 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏细胞凋亡的影响

图 5 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏细胞凋亡的影响Fig. 5 Effect of BA pretreatment on apoptosis of hepatocytes in mice induced by T-2 toxin

细胞发生凋亡时会激活DNA内切酶，使DNA发生断裂，断裂DNA暴露的3’-OH端能够在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下被绿色的荧光探针FITC所标记，进而反映细胞的凋亡情况。如图5所示，与空白对照组相比，T-2毒素组绿色荧光标记的凋亡细胞数量明显增多，而BA预处理后凋亡细胞数量呈剂量依赖性减少。以上结果表明，T-2毒素能够诱导小鼠肝组织中的细胞凋亡，而BA预处理能够减少细胞凋亡的发生。

2.6 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.6.1 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

如图6所示，与空白对照组相比，T-2毒素处理极显著升高了Bcl-2/Bax、剪切型Caspase-3/pro-Caspase-3比值（P＜0.01），表明T-2毒素能够激活促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并激活Caspase-3，从而诱导细胞发生凋亡。与T-2毒素组相比，BA预处理呈剂量依赖性极显著降低Bcl-2/Bax比值（P＜0.01），中、高剂量BA预处理显著降低剪切型Caspase-3/pro-Caspase-3比值 （P＜0.05）。以上结果表明，T-2毒素通过激活Bax和Caspase-3诱导肝细胞凋亡，而BA预处理能够抑制Bax和Caspase-3的激活，从而减少细胞凋亡的发生。

图 6 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达的影响Fig. 6 Effect of BA pretreatment on the expression of Bax, Bcl-2 and caspase-3 proteins in mice induced by T-2 toxin

2.6.2 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏细胞中JAK2、STAT3蛋白表达的影响

图 7 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝脏细胞中JAK2、STAT3 蛋白表达的影响Fig. 7 Effect of BA pretreatment on the expression of JAK2 and STAT3 proteins in hepatocytes of mice induced by T-2 toxin

如图7所示，与空白对照组比，T-2毒素处理升高小鼠肝脏细胞中p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3比值， 提示T-2毒素激活了JAK2/STAT3信号通路。与T-2毒素组相比，低、高剂量的BA预处理极显著降低了 p-JAK2/JAK2比值（P＜0.01）；与T-2毒素组相比，BA呈剂量依赖性降低了p-STAT3/STAT3比值，高剂量时差异极显著（P＜0.01），表明BA预处理抑制了JAK2/STAT3信号通路的激活。以上结果表明，BA缓解T-2毒素诱导的细胞凋亡可能与JAK2/STAT3信号通路有关。

3 讨 论

血清中ALT、AST、ALP活力直接反映肝脏功能状态和损伤程度[15-16]，其水平异常是诊断肝脏病变的重要指标，ALB/GLB比值对肝脏疾病的临床诊断和治疗同样具有重要意义[17-18]。有研究显示，在暴露于T-2毒素的山齿鹑和肉鸡肝脏中观察到坏死和脂肪堆积，同时AST、ALP和ALT水平升高，TP含量降低[19-20]。在本研究中也得到了相似结果，T-2毒素组小鼠血清ALP、ALT和AST活力极显著高于空白对照组，TP质量浓度和ALB/GLB比值极显著降低，提示T-2毒素可造成小鼠的肝损伤。而T-2毒素引起中毒的重要机制是氧化应激，通过降低SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性，增加ROS和MDA的产生，促进脂质过氧化，最终导致细胞甚至组织的 损伤[21-23]。在本研究中，T-2毒素极显著降低小鼠肝脏组织T-AOC，CAT、SOD活力和GSH含量，同时极显著增加MDA含量；病理剖检可见肝脏颜色呈粉白色，质地较硬且缺少弹性，肝脏边缘较钝；切片图像观察结果显示肝脏中肝索和肝窦消失，炎症细胞浸润和肝细胞坏死，提示氧化应激在T-2毒素引发的小鼠肝损伤过程中 起着重要作用，这与Deng Yijia等[24]的研究结果一致。BA作为一种天然产物，不仅可通过增强小鼠抗氧化能力减轻乙醇对小鼠造成的肝脏损伤[25]，也能够剂量依赖性地修复T-2毒素引起的人正常肝细胞（L02）氧化损伤[26]。因此，本研究探讨了BA对T-2毒素通过氧化应激导致小鼠肝细胞损伤的保护作用，结果显示，与T-2毒素组比较，BA预处理能够显著升高小鼠肝组织中T-AOC，SOD、CAT活力和GSH含量，并极显著降低MDA含量，拮抗由T-2毒素造成的肝脏氧化损伤。此外，BA预处理后可显著降低小鼠血清ALT、AST、ALP活力，升高TP水平和 ALB/GLB比值，表明BA预处理能够保护肝脏免受T-2毒素的毒性作用，显著减少肝脏炎性细胞的浸润及坏死细胞生成，改善肝脏的外观、色泽和质地。

研究发现，T-2毒素可激活线粒体信号通路中凋亡调节蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达，诱导L02肝细胞凋亡[27]。JAK2/STAT3信号通路是多种天然化合物和药物的有效靶点，参与调控肿瘤细胞增殖[28-29]。Zhang Lei等[30]研究发现，抑制JAK2/STAT3信号通路可以减轻氧化 应激，下调Bax/Bcl-2比值，抑制肾细胞凋亡，促进细胞存活。本研究中，TUNEL检测结果显示，T-2毒素诱导了小鼠肝细胞的凋亡；Western blot检测结果显示，T-2毒素上调了p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2、Bax/Bcl-2比值，以及Caspase-3的表达，而BA预处理能够显著下调 JAK2/STAT3信号通路和Bax/Bcl-2比值，抑制Caspase-3的激活，提示JAK2/STAT3调控的细胞凋亡可能在BA对T-2毒素致肝损伤的保护过程中发挥重要作用。

图 8 BA预处理对T-2毒素致小鼠肝损伤的保护作用及其机制Fig. 8 Protective effect of BA pretreatment on liver injury induced by T-2 toxin in mice and its underlying mechanism

本研究结果表明，BA对T-2毒素通过氧化应激所致的小鼠肝脏氧化损伤具有保护作用，而JAK2/STAT3介导的细胞凋亡可能在这一过程中发挥重要的调控作用 （图8），以上结果为将BA开发成一种T-2毒素解毒剂提供了关键的实验依据。