激素抵抗型支气管哮喘患者外周血MIB1基因甲基化的相关性研究

陈颖 冷秋平 王文艺 邬超 希仁娜依·木哈塔尔 陈丽萍

新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重症医学中心,乌鲁木齐830001

支气管哮喘(哮喘)是一种异质性疾病,以持续性气道炎症、气道高反应及气道重塑为特征,是常见的慢性呼吸系统疾病;其具有病程复杂、易复发等特点。有文献显示,2010年美国估计有2 570万人诊断哮喘[1]。而最新文献显示,目前全球约3.58亿人患有哮喘,我国约有4 000万哮喘患者[2]。

目前联合使用支气管扩张剂及吸入糖皮质激素成为最有效的治疗哮喘的方案。虽然国内外哮喘指南推出的药物治疗可使部分哮喘患者达到最佳的控制状态,同时降低了哮喘的病死率,但仍有部分哮喘患者未能达到理想的控制。据估计有5%～10%的哮喘患者难以通过现有的治疗方法得到疾病的良好控制[3]。这样的患者被标记为患有严重哮喘或难治性哮喘。而在难治性哮喘中,对糖皮质激素标准治疗的反应差或需要非常高的剂量以达到治疗目的,以至于产生严重的不良反应,被诊断为糖皮质激素抵抗型哮喘。临床上把糖皮质激素抵抗型哮喘定义为肺功能第1秒用力呼气容积占预计值百分比＜75%,在给予足够剂量的糖皮质激素治疗(40 mg/d,持续14 d)后,第1秒用力呼气容积占预计值百分比的改善率＜15%[4]。

激素抵抗型哮喘患者因症状反复发作,难以控制,导致反复就医,增加患者疾病负担的同时增加患者的医疗费用。所以对糖皮质激素抵抗型哮喘的认识有助于确定此类哮喘患者的特征,并有助于进一步明确其病理生理学过程,寻找可能有效的个体化治疗方案,减少疾病带来的负担。前期我们用Illumina法对4例激素抵抗型哮喘患者、普通哮喘患者、健康体检者进行了全基因组甲基化初筛分析,发现MIB1基因存在异常甲基化,故推测MIB1基因异常甲基化参与了激素抵抗型哮喘发病,本研究中我们扩大样本以探讨哮喘患者激素抵抗发生的机制,对未来的个体化治疗寻找理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年1月至2019年1月就诊于新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重症医学中心并采用《基于网络平台的多中心科研病例采集系统》(软件著作权登记号:2012SR117462,著作权人:邬超)进行管理的哮喘患者1 500例进行病例对照研究,对患者进行1年以上随访。选取符合激素抵抗型哮喘定义的患者20例、普通哮喘患者20例及健康体检者20名为研究对象,所有哮喘患者符合2016年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制订的《支气管哮喘防治指南(2016年版)》[5]中哮喘的诊断标准。排除存在风湿免疫系统疾病、血液系统疾病及其他需要使用激素治疗的合并症的人群,本研究获新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准(2015072),所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。收集研究对象的一般资料,包括性别、年龄、发病年龄、病程、体质量指数、吸烟情况、血嗜酸粒细胞计数、血中性粒细胞计数等。

1.2 方法 抽取所有研究对象的空腹外周静脉血标本,加入枸椽酸钠抗凝剂中,放于-80℃冰箱留存待用;通过亚硫酸氢盐转化、PCR扩增、体外转录和RNase A特异性酶切和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术,将DNA模板Cp G甲基化状态转变成RNA酶切片段的碱基差异,通过质谱判断相对分子质量的差异进行区分。

1.2.1 引物设计 使用Agena公司官网进行设计引物,扩增片段大小为200～600 bp。在正向引物5'端加入10 mer tag,反向引物5'端加入T7-Promoter序列。

1.2.2 DNA提取 使用QIAGEN试剂盒提取DNA,DNA用分光光度计定量;并取100 ng DNA,用0.8%琼脂糖凝胶电泳质检。质检合格的DNA将浓度调整到75 mg/L,转移至96孔板,-20℃储存备用。

1.2.3 DNA样品亚硫酸盐处理 采用EZ DNA Methylation Kit(ZYMO)试剂盒,严格按照试剂盒操作步骤,实验前的准备、DNA样品准备、DNA样品亚硫酸处理进行操作。

1.2.4 PCR扩增 采用PCR Accessory Set(Agena)试剂盒,PCR扩增的引物序列见表1。设置PCR扩增的程序如下。起始:94℃,10 min。循环1:94℃,45 s;62℃,48 s;-0.5℃冷却;72℃,1 min(共循环10次)。循环2:94℃,45 s;57℃,48 s;72℃,1 min(共循环35次)。最后72℃,3 min;4℃存储备用;最后PCR产物电泳采用2%的琼脂糖凝胶进行,取5μl,2×Loading Buffer于电泳板里,加入1μl PCR产物进行电泳。

1.2.5 碱性磷酸酶处理 采用MassCLEAVE Kit:(美国Agena公司),严格依照说明书配制碱性磷酸酶处理体系并操作。

1.2.6 体外转录和RNaseA特异性酶切 采用MassCLEAVE Kit试剂盒(美国Agena公司),严格按照说明书操作进行。

1.2.7 芯片点样及质谱检测 使用Mass ARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(美国Agena公司)将纯化后产物点至384格式的SpectroCHIP(美国Agena公司)芯片上,将点制好的芯片放入Mass ARRAY Compact System(美国Agena公司)进行检测。SpectroCHIP芯片使用MALDITOF基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术,检测数据通过EpiTYPER软件(美国Agena公司)分析并输出结果。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行统计学处理,计量资料以±s表示,两组比较采用成组设计t检验,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验。哮喘患者发生激素抵抗危险因素分析采用二分类Logistic回归分析,绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)并计算曲线下面积(area under curve,AUC),AUC及其95%置信区间通过MedCalc进行评估,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 激素抵抗型哮喘组男8例,女12例,年龄(62.00±13.1)岁,年龄范围为24～76岁;普通哮喘组男10例,女10例,年龄(60.30±13.28)岁,年龄范围为23～77岁;正常对照组男10例,女10例,年龄(57.90±10.87)岁,年龄范围为26～78岁。3组性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P值均＞0.05),具有可比性。

2.2 MIB1基因检测结果 检测MIB1基因片段长度为490 bp;测得MIB1基因检测片段的CpG位点总数3个Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3,实际检测到的Cp G位点数3个Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3。

2.3 3组MIB1基因Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3三个位点甲基化率比较 3组MIB1基因Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3三个位点的甲基化率比较差异均无统计学意义(χ2=1.591、0.546、0.282,P值均＞0.05),见表2。

2.4 两哮喘组临床指标和MIB1基因甲基化率比较 激素抵抗型哮喘组与普通哮喘组临床指标(发病年龄、体质量指数、嗜酸粒细胞计数、中性粒细胞计数)和MIB1基因CpG_1、CpG_2、CpG_3三个位点的甲基化率比较差异均无统计学意义(P值均＞0.05),见表3。

2.5 哮喘患者发生激素抵抗危险因素分析 以是否发生激素抵抗为因变量,以性别(赋值:男性=1,女性=2)、发病年龄、体质量指数、嗜酸粒细胞计数、中性粒细胞计数及Cp G位点甲基化率为自变量,进行logistic回归分析,单因素结果显示嗜酸粒细胞计数、Cp G_1甲基化率、Cp G_2甲基化率、Cp G_3甲基化率是哮喘患者发生激素抵抗的可能影响因素;将单因素分析中有统计学意义的4个变量带入Logistic回归模型进行危险因素分析,结果显示CpG_1甲基化率和CpG_3甲基化率是哮喘患者发生激素抵抗的危险因素,见表4、5。

表1 PCR扩增的引物序列

表2 3组MIB1基因Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3三个位点的甲基化率比较(%,±s)

表2 3组MIB1基因Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3三个位点的甲基化率比较(%,±s)

组别 例数 Cp G_1甲基化率 CpG_2甲基化率 CpG_3甲基化率正常对照组 20 0.64±0.21 0.76±0.24 0.94±0.17激素抵抗型哮喘组 20 0.71±0.21 0.81±0.18 0.95±0.15普通哮喘组 20 0.59±0.22 0.75±0.17 0.90±0.23 F值 1.591 0.546 0.282 P值 0.213 0.582 0.756

表3 两哮喘组临床指标及甲基化率比较(±s)

表3 两哮喘组临床指标及甲基化率比较(±s)

组别 例数 发病年龄(岁)体质量指数(kg/m2)中性粒细胞(×109/L)嗜酸粒细胞(×109/L)Cp G_1甲基化率(%)Cp G_2甲基化率(%)CpG_3甲基化率(%)激素抵抗型哮喘组 20 50.74±14.48 24.91±3.76 4.90±1.41 0.60±0.94 0.71±0.21 0.81±0.18 0.95±0.15普通哮喘组 20 47.05±16.03 25.34±4.03 4.35±2.10 0.24±0.30 0.59±0.22 0.75±0.17 0.90±0.23 t值 0.745 -0.337 0.948 1.569 1.748 1.115 0.684 P值 0.461 0.738 0.349 0.131 0.089 0.273 0.498

2.6 Cp G_1、Cp G_3位点甲基化率对哮喘患者激素抵抗影响因素的预测分析 用激素抵抗型哮喘组及普通哮喘组的Cp G_1、Cp G_3位点甲基化率数据构建ROC曲线,计算AUC,结果显示Cp G_1甲基化率AUC(AUC=0.734)优于Cp G_3甲基化率AUC(AUC=0.564),两者约登指数比较,CpG_1甲基化率(约登指数1.478)优于Cp G_3甲基化率(约登指数1.182)考虑Cp G_1甲基化率及CpG_3甲基化率可以作为哮喘患者发生激素抵抗的预测指标,但Cp G_1甲基化率预测效能更优,见表6、图1。

图1 激素抵抗型哮喘组及普通哮喘组临床特征及CpG位点甲基化率的受试者工作特征曲线

表4 影响哮喘患者激素抵抗相关因素的单因素分析

表5 影响哮喘患者发生激素抵抗的多因素分析

表6 CpG_1、CpG_3位点甲基化率预测哮喘患者激素抵抗的AUC

3 讨论

随着对哮喘认识的深入,哮喘逐渐被认为是一个涵盖了多种不同表型的总称,这些表型可能由不同的途径介导[4]。而由不同机制引起的哮喘表型的临床特征也得到了确认,特别是在那些患有严重哮喘的患者中,能解释不同患者在激素治疗的疗效有明显的不同。

哮喘的病理生理机制是由不同类型的分子和细胞成分通过各种动态模式的复杂网络相互作用而形成的。涉及炎症、细胞免疫、体液免疫、固有免疫、细胞增殖、细胞凋亡和代谢的生物学过程,需要与哮喘的临床和表型表达联系起来。对来自基因组学、转录组学、脂质组学和蛋白质组学的临床、生理和高通量数据的分析将为单个患者提供更复杂和更准确的内型表征。此外,表观遗传机制如DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNAs可以调节环境影响,如空气污染、吸烟等,虽然不改变核苷酸序列,但也影响哮喘的发展和病程[6]。研究表观遗传机制也可能会找到特定患者的内型表征,为开展个体化治疗提供理论依据。

糖皮质激素一直是控制哮喘气道炎症的一线药物,但有部分患者对激素治疗的反应较差,表现为高剂量激素治疗症状也不易被控制,并且病情反复出现急性加重。这类患者虽然只是哮喘患者中的一小部分,但对于临床医生来说,诊断这部分患者是较大的挑战,往往需要先鉴别是否有合并疾病或有无其他诱因未能去除而导致治疗效果不佳,例如有无合并存在胃食管反流性疾病或有无过敏源的持续暴露未能去除等,或者是否有药物使用方法及剂量的问题导致治疗效果未达到预期,往往在排除了相关因素,并反复调整治疗方案后,才能最终临床诊断为激素抵抗型哮喘,使得这部分患者反复就医,给个人及社会造成了不成比例的医疗负担。这类患者也是哮喘治疗领域迫切需要解决的问题。目前激素抵抗型哮喘发病机制尚未完全明确,但一些可能的机制已经被提出,这些因素可以大致分为外部因素和内部因素,包括了特定分子、受体、炎症细胞或免疫过程。同一患者可能同时并存多种机制[7]。外部因素包括吸烟、气道炎症、气道重塑等。内部因素的研究分为以下5个方面。(1)糖皮质激素受体异常:具体机制包括糖皮质激素受体亚单位表达增加、糖皮质激素受体核转位缺陷、糖皮质激素受体翻译后修饰异常。(2)组蛋白去乙酰化异常:组蛋白去乙酰化酶是炎症基因诱导的重要环节,炎症细胞中组蛋白去乙酰化酶2活性与细胞对激素的敏感性呈正相关已被证实[8]。(3)Raf/Mek/Erk三大类蛋白激酶异常:主要由Raf/Mek/Erk3蛋白激酶组成的丝裂原活化蛋白激酶是肺部支气管细胞内外信号转导的重要传递者,现有报道Raf-1、Mek1/2、Erk1/2基因在激素抵抗型哮喘患者的气管黏膜异常高表达[9]。(4)促炎转录因子表达增加:信号转导和转录激活因子5能够参与糖皮质激素受体核转位及与DNA结合缺陷的发生;活化蛋白1与其他转录因子竞争性结合糖皮质激素受体单体,抑制糖皮质激素受体功能;哮喘患者外周血中单个核细胞核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表达越低,其对激素治疗的敏感度越好。(5)辅助性T细胞及其细胞因子的参与:哮喘发病机制中的Th1/Th2失衡理论不能解释激素抵抗型哮喘的病理生理过程,已有研究报道,激素抵抗型哮喘患者体内Th17细胞分泌的IL-17水平明显高于正常人,并且是加重其气道炎症的重要因素。最近的证据也表明,IL-17A过表达可能是严重和激素抵抗型哮喘的标志物和危险因素[10]。

MIB1是一种贯穿表达于增殖细胞中的核抗原,参与泛素循环及Notch信号转导途径。(1)Notch家族在胚胎发育形成、细胞分裂增殖、增生、凋亡、免疫细胞分化及其基本功能调控等方面均起到极为重要的作用,研究表明Notch信号通路对Th17细胞的发育、分化均起到极其重要的调节作用。Th17细胞是一类独立于Th1和Th2的细胞亚群,具备独立的分化和发育调节机制,有研究报道,Th17细胞分泌的IL-17正向调节气道上皮糖皮质激素受体β的表达,而糖皮质激素受体β对哮喘患者产生糖皮质激素低反应有重要作用,故我们推测MIB1基因通过Notch信号转导途径调节Th17细胞,从而参与激素抵抗型哮喘的病理生理[11]。(2)NF-κB是普遍存在于各组织中的炎症转录因子,在免疫及炎症反应中起到极其重要的作用。有研究报道,干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)是发生糖皮质激素抵抗的可能诱因,与普通哮喘患者相比,激素抵抗型哮喘患者的IFN-γ水平显著增高,IFN-γ诱导基因对糖皮质激素的差异敏感度源于对NF-κB信号通路的变量依赖性,糖皮质激素敏感的IFN-γ诱导基因对NF-κB依赖性更高,同时在细胞核NF-κB的过度活化可降低糖皮质激素应答原件的亲合力,故猜测NF-κB与IFN-γ共同参与了哮喘患者的激素抵抗[12]。Liu等[13]报道,在体外细胞实验中,MIB1基因正向调控NF-κB的活性,并呈剂量依赖性,故我们猜测MIB1基因通过调控NF-κB的活性,从而参与激素抵抗型哮喘的病理生理。(3)近年研究显示,在血液系统疾病治疗反应中,糖皮质激素治疗的耐药机制与MIB1基因有关。王珊等[14]研究显示MIB1基因的表达与弥漫大B细胞淋巴瘤患者的生存时间呈线性相关,其中位生存期与糖皮质激素初治反应相关,故猜测MIB1基因同时也参与了弥漫大B细胞淋巴瘤对糖皮质激素的治疗反应,高海丽等[15]研究显示预后不良的T淋巴细胞白血病患者其NF-κB表达高于预后良好的T淋巴细胞白血病患者,故猜测NF-κB参与了淋巴细胞白血病对糖皮质激素的治疗反应。基于以上研究的理论,推测MIB1基因甲基化与哮喘患者治疗的激素抵抗性相关。本实验前期我们用Illumina法甲基化芯片技术进行了全基因组的甲基化初筛分析,筛选出数个存在异常甲基化的基因,最终我们选择MIB1基因进行进一步验证。

综上,本研究中结果显示激素抵抗哮喘组、普通哮喘组、正常对照组Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3甲基化率比较差异无统计学意义。在普通哮喘及激素抵抗型哮喘患者组中行Logistic回归分析提示Cp G_1甲基化率及Cp G_3甲基化率可能为哮喘患者发生激素抵抗的预测指标,且Cp G_1甲基化率预测效能更优。分析扩大样本再统计并进一步做与Cp G_1甲基化率相关的上游或下游指标,或联合相关指标可能进一步证实Cp G_1甲基化率与激素抵抗的相关性,并可能可以作为预测激素抵抗发生的指标。本研究显示其他临床指标如发病年龄、体质指数、血白细胞计数、血嗜酸粒细胞计数等进行统计分析,均未证明与支气管哮喘患者发生激素抵抗有明确相关性。原因考虑本实验室检测的标本为血,结合其他文献结果推测如检测支气管肺泡灌洗液嗜酸粒细胞计数可能会有阳性发现,但鉴于临床此类患者住院时往往疾病状态较重,进行气管镜检查有一定风险,患者的依从性较差,故本次研究尚未设计支气管肺泡灌洗液进行相关指标检测,以后待进一步行更大临床样本,更多样本类型相关指标的检测,并联合相关指标进行统计分析,以探讨哮喘患者激素抵抗发生的危险因素以及寻找更好的临床预测方法,对未来的个体化治疗寻找理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突