青花菜总硫代葡萄糖苷提取工艺的优化

贺霞　张子轩　张宇光　张文泽　白瑞　张静

摘 要：以青花菜中青9号品种为试材，从灭酶处理、干燥处理和提取条件3个方面对青花菜花球中总硫代葡萄糖苷提取工艺进行优化。运用氯化钯分光光度法，比较分析经过不同处理后的青花菜花球总硫代葡萄糖苷含量，以期筛选出总硫苷提取的最佳工艺。结果表明，不同处理对青花菜花球中总硫代葡萄糖苷含量的影响有一定差异。加入100 ℃蒸馏水后80 ℃热处理15 min的灭酶处理，70 ℃鼓风干燥，乙醇浓度90%、料液比1∶9、提取温度60 ℃、提取时间30 min的提取条件下测得青花菜花球中总硫苷含量（b）最高，为414.98 μmol·g-1，此处理为青花菜花球中总硫苷提取最佳工艺。

关键词：青花菜;总硫代葡萄糖苷;提取工艺;优化

中图分类号：S635 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）04-062-06

Abstract： In this study， the extraction process of total glucosinolates from broccoli was optimized from three aspects： enzyme-inactivation， drying and grinding， and extraction condition， and the broccoli variety Zhongqing 9 hao was used as material in this study. In order to screen out the best extraction process of total glucosinolates， the total glucosinalates contents of broccoli with different treatments were compared and analyzed by palladium chloride-spectrophotometer. The results showed that the effects of different treatments on the total glucosinolates contents of brocolli were significantly different. Under the conditions of 100 ℃ distilled water， 80 ℃ heat treatment for 15 min， 70 ℃ air drying， 90% ethanol concentration， 1：9 ratio of solid to liquid， 60 ℃ extraction temperature and 30 min extraction time， the content of total glucosinolates in broccoli was the highest （414.98 μmol·g-1）， which was the best extraction process of total glucosinolates from broccoli.

Key words： Broccoli; Total glucosinolates; Extraction process; Optimization

青花菜（Brassica oleracea var. italica）又名绿花菜，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种[1]。青花菜营养物质丰富，主要含有蛋白质、脂肪、膳食纤维、糖类、胡萝卜素和维生素，并且含有丰富的矿物质，被称为高营养蔬菜[2-3]。研究表明，青花菜中硫代葡萄糖苷含量丰富，虽然总含量在同科蔬菜中并不是最高，但具有明显抗癌生物活性的萝卜硫素含量很高[4-6]。

硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GLs，简称硫苷）是一种含硫的植物次级代谢产物，在十字花科蔬菜中种类和含量最丰富，目前已发现120多种[7]。富含硫苷的食物具有特殊风味和保健作用，这与硫苷的降解产物有关，其降解产物在抗菌抑虫、引发生物抗癌抑癌等方面具有重要的作用[6]。研究表明，当植物中含有硫代葡萄糖苷的同时，也含有降解硫代葡萄糖苷的酶类，这种酶就是黑芥子酶[8]。当植物器官被切碎或咀嚼时，硫代葡萄糖苷会与植物内部的黑芥子酶发生酶解反应，使硫代葡萄糖苷水解，从而产生异硫氰酸、腈等一些对人类有害的物质[9]。此外当外界环境有所改变时硫苷也会有一定的非降解反应[10]。

目前已有的总硫苷含量检验方法主要有BaSO4重量法、近红外光谱法、高效液相色谱法、氣相色谱法等[11-13]。本试验采用氯化钯法对总硫苷含量进行测量，该方法具有操作简单、准确、快速等优点，只要保证测量时所需的温度时间等条件即可，其原理是钯离子与硫代葡萄糖苷生成一种有色络合物，再利用紫外分光光度计进行吸光值的测量[13]。

近几年，对硫苷的研究多为对其单体结构的鉴定分析，对提取工艺的研究较少[14]。不同研究者对青花菜硫苷提取工艺进行了优化，李宁[6]通过单因素试验得到西兰花干硫苷的最佳提取工艺：90%乙醇作为提取剂，料液比1∶11，提取时间为1 h，重复提取4次，得到硫苷纯度为15.22 mg·g-1;贾治勇等[15]通过单因素和正交试验，得到西兰花茎中提取硫苷的最佳工艺条件为：乙醇浓度75%、料液比为1∶15、提取温度为70 ℃、提取时间为30 min，在此条件下提取物中硫苷的提取质量摩尔浓度为601.24 μmol·g-1;邓艳美等[16]通过单因素和正交试验，得到青花菜干粉中提取硫苷的最佳条件为乙醇浓度75%、料液比为1∶7、提取温度80 ℃、提取时间为20 min，提取液中硫代葡萄糖苷质量摩尔浓度达到33.71 μmol·g-1。不同研究者得到的结果不同，笔者通过对青花菜花球中总硫苷的提取工艺的研究，提高其利用率，尤其在抗癌抑癌方面，旨在为人类健康做一些贡献，也为后续硫代葡萄糖苷的相关研究提供了一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料中青9号，种子购自中蔬种业科技（北京）有限公司。

1.2 方法

供试材料于2018年7月1日浸种催芽，7月6日播种至50孔穴盘，8月10日左右定植于山西农业大学园艺站试验田，株距为40 cm，行距50 cm，常规田间管理。10月上旬采收花球，随机选取9个花球，3个花球混合为1个生物学重复，总共3个重复。

1.3 试验设计

1.3.1 灭酶处理 每个生物学重复精确称取15 g材料，将其放入试管中，加入100 ℃蒸馏水或75 ℃的95%乙醇，按照表1进行微波处理或热处理。

1.3.2 干燥处理 将灭酶处理后的试材纱布过滤，收集滤渣，包裹标记好后采用以下3种干燥方式进行干燥处理，微波处理每隔30 s称重1次，烘干至重量恒重。鼓风处理每隔30 min称重1次，烘干至重量恒重。干燥后研钵研磨至细粉，100目过筛。3种干燥处理如下：

（1）微波干燥：低火（V-1）、中低火（V-2）、中火（V-3）、中高火（V-4）和高火（V-5）;

（2）鼓风干燥：在烘箱中进行，50 ℃（G-1）、60 ℃（G-2）、70 ℃（G-3）、80 ℃（G-4）、90 ℃（G-5）和100 ℃（G-6）;

（3）冷冻干燥：冷冻干燥机内-50.4 ℃，干燥24 h（L-1）。

1.3.3 硫苷提取工艺最优设计 本试验以前人研究结果为基础，因素水平如下所述—A. 提取时间：4个水平，0、1、2、3分别代表15、30、45、60 min;B. 提取温度：4个水平;0、1、2、3分别代表60、70、80、90 ℃;C. 料液比：4个水平，0、1、2、3分别代表1∶9、1∶12、1∶15、1∶18;D. 乙醇浓度（φ）：5个水平，0、1、2、3、4分别代表50%、60%、70%、80%、90%。若实施全部水平组合，则需安排320个水平组合，故采用最优试验设计[17-18]。本试验选取D-最优设计准则，即以信息矩阵行列式最大为准则。本试验列出25个水平组合（表2）是应用SAS9.2软件分析而获得的，其选取效率为96%。故采用四因素最优设计，探索适宜青花菜总硫代葡萄糖苷的提取工艺，用表2方式提取，每个方式各3次重复。

1.4 硫苷总量测定

每份材料经过不同处理后，将滤液收集到10 mL带塞玻璃试管中，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀。移取上清液1 mL，并放入另一个试管中，再加入2 mL氯化钯显色液，摇匀，在室温下静置2 h。标准曲线制作参照邱海荣[7]的方法。

1.4.1 吸光值测定 用紫外分光光度计在波长540 nm下测定待测液的吸光值，将吸光值带入标准曲线得到硫苷含量。

1.4.2 标准曲线制作 在20 mL烧杯中加入称取准确量0.039 7 g标准品2-丙烯基硫苷（分子质量为397.46），然后加入适量蒸馏水进行溶解，溶解后将该溶液用蒸馏水定容至20 mL，制得硫苷标准液。用移液枪分别取1、2、3、4、5 mL硫苷标准液于5个10 mL带塞玻璃试管中，蒸馏水分别定容至10 mL。定容完毕后，采取与试验材料相同的步骤进行吸光值的测定[7]。

图1为标准品2-丙烯基硫苷制得的标准曲线。标准曲线的线性方程式：y =0.003 8x-0.002 4，R?=0.997 8。式中：y表示溶液在分光光度计中测定的吸光值;x表示硫苷含量。将上述待测溶液的吸光值代入即可求得所对应的硫苷含量。

1.5 数据分析

利用Microsoft Excel 2010软件进行数据整理与图表制作，用SAS（Statistics Analysis System）软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭酶处理对青花菜总硫苷含量的影响

由图2可以看出，不同灭酶处理对青花菜总硫苷含量的影响不同。其中，100 ℃蒸馏水80 ℃热处理15 min提取的青花菜总硫苷含量最高，75 ℃ 95%乙醇80 ℃热处理15 min提取的青花菜总硫苷含量最低;100 ℃蒸馏水80 ℃热处理3个不同处理时间下提取的青花菜总硫苷含量均显著高于其他处理方式下提取的青花菜总硫苷含量;75 ℃ 95%乙醇80 ℃热处理3个处理时间下提取的青花菜总硫苷含量均显著低于其他处理。

2.1.1 不同处理试剂对青花菜总硫苷含量的影响 相同微波处理时间条件下加入不同试剂，青花菜總硫苷含量差异显著。其中，微波处理30 s和60 s，100 ℃蒸馏水微波处理提取的硫苷含量均显著高于75 ℃95%乙醇微波处理。微波处理时间为90 s时，75 ℃95%乙醇微波处理提取的总硫苷含量显著高于100 ℃蒸馏水微波处理。

相同热处理时间条件下加入不同试剂，青花菜总硫苷含量差异显著。100 ℃蒸馏水处理所提取出的总硫苷含量均显著高于75 ℃95%乙醇所有热处理。由此可知，在热处理条件下，使用100 ℃蒸馏水作为试剂提取效果更好。

2.1.2 不同处理方式对青花菜总硫苷含量的影响 加入100 ℃蒸馏水时，热处理提取出的总硫苷含量显著高于微波处理。加入100 ℃蒸馏水时，微波处理30 s和60 s提取的青花菜总硫苷含量差异不显著;微波处理90 s提取的青花菜总硫苷含量则显著低于30 s和60 s处理。加入100 ℃蒸馏水时，热处理80 ℃ 15 、20 和25 min，青花菜总硫苷含量差异显著，提取的总硫苷含量随热处理时间增加而呈现递减态势。

加入75 ℃95%乙醇，微波处理提取出的总硫苷含量显著高于热处理，两种处理方式提取的总硫苷含量都随处理时间增加呈现递增态势。微波处理90 s提取的青花菜总硫苷含量显著高于30 s和60 s，热处理不同时间提取的总硫苷含量差异不显著。

2.2 不同干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响

由图3可以得出，不同干燥处理对青花菜花球总硫苷含量的影响不同。其中冷冻干燥处理青花菜花球测得的总硫苷含量最低;70 ℃鼓风干燥处理青花菜花球测得的总硫苷含量最高;微波干燥处理梯度间差异相对于鼓风干燥处理梯度间差异较大，微波干燥处理下测得青花菜总硫苷含量（b，后同）最大值和最小值相差34.92 μmol·g-1，而鼓风干燥处理下测得青花菜总硫苷含量最大值和最小值相差30.48 μmol·g-1。

2.2.1 微波干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响 在微波干燥处理中，微波中高火处理条件下青花菜总硫苷含量显著高于其他火力处理;除微波中火处理外，微波低火处理条件下青花菜总硫苷含量显著低于其他火力處理;微波低火与微波中火、微波中低火与微波中火、微波中低火与微波高火间均没有显著性差异。

2.2.2 鼓风干燥处理对青花菜总硫苷含量的影响 在鼓风干燥处理中，鼓风干燥70 ℃显著高于其他鼓风干燥处理;除鼓风干燥60 ℃外，鼓风干燥50 ℃和鼓风干燥100℃显著低于其他鼓风干燥处理;鼓风干燥50 ℃、60 ℃和100 ℃没有显著性差异;鼓风干燥60 ℃和鼓风干燥80 ℃没有显著性差异;鼓风干燥80 ℃和鼓风干燥90 ℃没有显著性差异。

2.3 不同提取条件对青花菜总硫苷含量的影响

由表3可知，不同提取方式对青花菜总硫苷含量的影响不同。在乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度有差异时，青花菜中提取到的总硫苷含量也有差异。在25个处理中，在A1B0C0D4、A3B2C3D4、A0B0C3D3 处理下所提取出来的青花菜花球总硫苷含量分别为414.98、391.03、323.92 μmol·g-1，均显著高于其他处理所提取出来的总硫苷含量。而在A0B3C2D0、A1B3C3D1、A2B3C3D0、A3B3C0D1处理下所提取出来的青花菜总硫苷的量均显著低于其他处理，且提取出的总硫苷含量都低于在100 μmol·g-1，且这4组的温度都为90 ℃，表明提取温度90 ℃太高会影响硫苷含量的提取。乙醇浓度90%、料液比为1∶9、提取温度60 ℃、提取时间为30 min提取得到的总硫苷含量最高。

3 讨论与结论

在最近几年中，硫苷的提取鉴定引起了研究人员的极大兴趣。在《青花菜抗癌原理被发现》[19]一文中，青花菜的抗癌功效被证实，越来越多的人开始关注青花菜。沈莲清等[20]通过对西兰花种子中的硫苷进行了提取，验证了萝卜硫素对5种肿瘤细胞株均有显著的体外增殖抑制活性。黑芥子酶是降解硫苷的主要酶源，因此成为了抗癌研究的新方向[19]，丁艳等[22]通过对油菜籽饼粕中硫苷的酶解条件优化的研究，表明了黑芥子酶在不同条件下对硫苷的降解产物生成量存在差异。因此，想要在植物中提取高含量的硫苷，首先应该进行灭酶处理，以防硫苷酶解生成其他有害物质。

本试验研究结果表明，不同灭酶处理提取出的总硫苷含量存在差异，以100 ℃蒸馏水热处理提取效果最好。其中，试剂不同，相同处理方式提取的总硫苷含量不同，100 ℃蒸馏水提取的硫苷含量比75 ℃95%乙醇提取的总硫苷含量要高;相同的试剂，不同的灭酶处理方式提取的总硫苷含量也不同，100 ℃蒸馏水热处理提取硫苷含量显著高于微波处理提取总硫苷含量，75 ℃95%乙醇微波处理提取的总硫苷含量要高于热处理。

韩梦凡[23]研究表明结球甘蓝在干燥过程中显著抑制硫苷成分的降解，减少了有害产物的生成量，表明干燥处理对硫苷含量的提取有影响。本试验结果表明，鼓风干燥条件下，温度为50 ℃、60 ℃时干燥较慢，时间略长，使硫苷在干燥过程中发生降解，虽然80 ℃、90 ℃、100 ℃时青花菜花球水分散失较快，但高温还会使硫苷发生降解，所以70 ℃时干燥处理效果最好。相对于鼓风干燥而言，微波干燥迅速，时间短，并且受热均匀，火力中高火时效果最好，但为了防止过度受热使硫苷发生降解，需要在干燥过程中多次测量散失水分的质量，可能导致所需火力不能一直保持，增加了干燥时间，使得硫苷发生了降解。

李宁[6]在西兰花干硫苷的提取中，发现提取硫苷最佳的工艺条件为乙醇浓度为70%、料液比1∶10、提取温度80 ℃、提取时间为40 min;贾治勇等[15]在西兰花茎中硫苷的提取工艺研究中发现提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度75%、料液比1∶9、提取温度70 ℃、提取时间30 min;邓艳美[16]在青花菜硫代葡萄糖苷的提取工艺中发现提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度75%、料液比1∶7、提取温度80 ℃、提取时间30 min。本试验结果表明，提取硫苷的最佳的工艺条件为乙醇浓度90%、料液比1∶9、提取温度60 ℃、提取时间30 min，其中最佳提取时间和料液比与前人的研究基本保持一致，但乙醇浓度和提取温度有所偏差。本试验最佳提取温度为60 ℃，这与李宁[6]研究得出的随着温度的提高硫苷提取含量增加的结论有差异，可能与试验材料品种等因素有关。本试验提取最佳乙醇浓度为90%，这与贾治勇等[15]研究得出的随着乙醇浓度增大硫苷提取量增大，但在75%达到最大值的结论有差异，可能是与测定的部位等因素有关。

综上所述，加入100 ℃蒸馏水后80 ℃热处理15 min灭酶处理，70 ℃鼓风干燥，乙醇浓度90%、料液比1∶9、提取温度60 ℃、提取时间30 min的提取条件下测得青花菜花球中总硫代葡萄糖苷含量最高，为414.98 μmol·g-1，其为花青菜花球中总硫苷提取的最佳工艺。

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