4种微生物菌剂对多年连作甜瓜土壤真菌群落的影响

马二磊　黄芸萍　臧全宇　郝芳敏　丁伟红　王毓洪　高海东　刘磊

摘 要： 为了探究微生物菌剂对土壤真菌群落及成员的影响，利用4种微生物菌剂（A.谷乐丰聚谷氨酸微生物菌剂，B.启高系列生物菌剂，C.施特葆系列菌剂，D.新型菌剂NBmelon）对土壤进行处理，样品经DNA抽提、PCR扩增和真菌ITS测序，进行分析制图。结果显示，处理B和A的Shannon指数、Simpson指数高于CK，处理D、C的Simpson指数高于CK，表明菌剂处理后，土壤真菌群落均匀度得到提高，真菌多样性优于CK。优势种群相对丰度在不同处理间存在差异，处理A、B、D与CK相比分布在不同象限，且图中距离较远，表明菌剂处理后土壤样品的物种构成发生了变化。处理D（新型菌剂NBmelon）具有降低镰刀菌属相对丰度的效果，能减少镰刀菌属群落数量，可供后续开发利用。因此，施用微生物菌剂具有改变土壤真菌群落结构、提高土壤真菌多样性、降低有害菌镰刀菌属相对丰度、改良土壤的作用。

关键词：甜瓜;微生物菌剂;土壤;真菌群落;连作

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）04-015-06

Abstract： In order to explore the effects of microbial agents on soil fungal community and its members. Four kinds of microbial agents（A. GuLeFeng polyglutamic acid microbial agent， B. QiGao series of microbial agents， C. SuTiBu series of microbial agents， D. New microbial agent NBmelon） were used to treat the soil， and clear water was used as CK. Soil samples were extracted by DNA， amplified by PCR， and sequenced by ITS. Alpha diversity， community composition， PCA and other basic fungal diversity were analyzed and mapped. The results showed thatthe Shannon index and Simpson index of treatment B and A were higher than CK， and the Simpson index of treatment D and C were higher than CK， which indicated that the uniformity of soil fungal community was improved and the fungal diversity was better than CK. The relative abundance of dominant population was different among different treatments. Treatment A， B and D were distributed in different quadrants compared with the control， and the distance in the figure was far， indicating that the species composition of soil samples changed after the treatment. Treatment D （a new fungicide NBmellon） had the good antagonistic effect on reducing the abundance of Fusarium species， which could reduce the number of Fusarium community， and could be used for further development. Therefore， the application of microbial agents can change the community structure of soil fungi， improve the diversity of soil fungi， reduce the abundance of Fusarium species， and improve the soil.

Key words： Melon; Microbial agent; Soil; Fungal community; Continuous cropping

甜瓜是我國重要的园艺经济作物之一，但受耕地的限制，甜瓜连作现象十分普遍，长期连作导致了土壤微生物菌群失衡，有害病原微生物大量繁殖，病虫害发生频繁，土传病害逐年加重[1-3]。枯萎病[4-5]、根腐病[6]、果腐病[7-8]是主要的镰刀菌属病害，也是重要的土传病害，一旦发生往往造成重大损失，连作加重了这些病害的发生蔓延。近年来，土壤真菌多样性的研究受到了广泛的关注。土壤含有丰富的微生物资源，是地球上最复杂的微生态系统之一[9]。土壤是地球生态圈内化学反应最活跃的生态区域，是农作物生长发育的载体，满足了植物基本的养分供给需求，土壤的质量直接影响农产品的产量与品质。土壤微生物是土壤生态系统的组成成分，在植物的生长发育过程中发挥着关键作用[10]，微生物的多样性与结构组成是衡量生态功能的重要指标[11]，可以通过构建土壤微生物组达到土壤健康的目的[12]。微生物菌剂是对植物生长发育有益的一类生物菌剂，在土壤中形成有利于作物生长的微生物优势菌群，既能提高肥效，达到增产和提质的目的，又能节约成本、减少环境污染、提高土壤中的生物多样性、减轻病害[13]。国内科研人员针对微生物菌剂对土壤真菌群落的影响开展了相关研究，普遍认为可以提高土壤真菌多样性，减少病害发生。齐钊等[14]发现联合施用复合微生物菌剂和氨基酸水溶肥，对土壤理化性质和细菌群落结构具有明显的改善作用。陈文等[15]认为与化肥处理相比， 施用生物有机肥后土壤微生物AWCD 值、Simpson 指数、Mc Intosh指数均提高，土壤微生物活性、多样性和均一度提高。马慧媛等[16]认为微生物菌剂能够提高土壤微生物的Shannon指数、降低Simpson指数，具有改善土壤营养状况、增加土壤可培养微生物数量、提高土壤微生物多样性的作用。张春怡等[17]认为土壤消毒并配施枯草芽孢杆菌可以增加土壤毛壳菌、被孢酶属等有益菌相对丰度，降低镰刀菌属、马杜拉分枝菌属等有害菌相对丰度。胡可等[18]发现菌剂与缓释肥配施不但可以提高土壤微生物功能多样性，而且还可以提高土壤微生物群落均匀度，从而促进土壤微生物生态系统的稳定，提高土壤微生物群落的生态功能。但微生物菌剂对多年连作甜瓜土壤真菌群落的影响研究尚未见报道。笔者通过探究微生物菌剂对土壤真菌群落分布的影响，旨在全面了解本地区土壤真菌群落的组成和结构，探明不同微生物菌剂的施用效果，为指导微生物菌剂的田间使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2020年4月9日至5月19日在宁波市东钱湖旅游度假区高钱村高新农业技术实验园区玻璃温室进行，选择多年种植甜瓜连作严重连栋玻璃温室地块，采用九点取样法取20～30 cm耕层土壤，将土壤混匀敲碎后过筛去除大颗粒土壤，取8 kg土壤放置于花盆中。

1.2 试验设置

试验设置5个处理，A：谷乐丰聚谷氨酸微生物菌剂，B：启高系列生物菌剂，C：施特葆系列菌剂，D：本实验室筛选新型菌剂NBmelon，CK：清水对照。每个处理按照厂家推荐浓度连续使用3次，具体成分和使用方法见表1。采用随机区组设计，每个处理3次重复，每10 d处理1次，共处理3次。每次浇灌微生物菌剂1 L，最后1次处理20 d后取土样进行检测。

1.3 高通量测序

土壤样品送南京集思慧远生物科技有限公司，对土壤真菌进行DNA抽提、PCR扩增和真菌ITS测序，设计ITS 1区特定引物扩增特异区域，得到310 bp左右扩增片段。加接头，测序得到2X250 bp的paired-end数据，通过拼接，可以得到较长序列，从而进行ITS分析。采用Magen Hipure Soil DNA Kit土壤DNA小量提取試剂盒（广州美基生物科技有限公司生产）进行DNA提取，真菌ITS测序使用ITS1F（5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）和ITS1R（5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）引物对ITS 1区进行PCR扩增。采用Illumina公司的NovaSeq 平台对样品进行高通量测序，并进行Alpha多样性、群落构成、PCA等基础真菌多样性分析和制图。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用DPS 16.05进行统计分析，采用Tukey法进行多重比较，并利用Excel 2013进行相关参数的计算和制图。

2 结果与分析

2.1 真菌群落Alpha多样性

多年连作甜瓜土壤真菌群落Alpha多样性如表2所示。多重比较显示，5个处理的Chao1指数、observed species指数、Shannon指数、Simpson指数、PD_whole_tree 指数、goods_Coverage指数差异不显著。真菌群落的覆盖率为99.95%～99.97%，表明所建立的文库能够比较真实、有效地反映样本环境真菌的多样性，具有研究意义和实用价值。Chao1指数和observed species指数反映样品中群落的丰富度，即简单指群落中物种的数量，而不考虑群落中每个物种的丰度。在5个处理中，CK的Chao1指数和observed species指数最大，分别为309.41和280.00，表明在使用微生物菌剂后，土壤真菌群落物种的数量呈下降趋势。Shannon指数和Simpson指数反映样品群落的多样性，综合衡量样品的物种丰富度和均匀度。处理B和A的Shannon指数高于CK（2.44），分别为2.91和2.83，表明处理B和A的真菌多样性高于CK;处理A、D、B、C的Simpson指数高于CK（0.56），分别为0.63、0.63、0.61、0.59，表明处理A、D、B、C的真菌多样性高于CK。PD_whole_tree 指数反映样品群落中的种、属数，处理B的PD_whole_tree 指数高于对照CK，表明处理B的真菌多样性高于CK。施用微生物菌剂可以降低土壤真菌群落的物种数量，提高真菌群落的多样性。

2.2 物种分类构成及丰度分析

对土壤样品物种分类构成及丰度进行分析并作图。在纲水平上的土壤真菌群落结构组成表明（图1），排前十的优势菌纲分别为：Sordariomycetes（粪壳菌纲）、Pezizomycetes（盘菌纲）、Eurotiomycetes（散囊菌纲）、Agaricomycetes（伞菌纲）、Geminibasidiomycetes（双担菌纲）、Leotiomycetes（锤舌菌纲）、Lecanoromycetes（茶渍纲）、Dothideomycetes（座囊菌纲）、Mortierellomycetes（被孢霉纲）、Saccharomycetes（酵母纲），其5个处理的平均相对丰度分别为61.75%、18.43%、8.89%、1.81%、0.67%、0.45%、0.29%、0.23%、0.08%、0.03%。Pezizomycetes（盘菌纲）相对丰度在处理A、C、D中增加，Eurotiomycetes（散囊菌纲）和Agaricomycetes（伞菌纲）相对丰度在处理A和B中增加，Geminibasidiomycetes（双担菌纲）和Leotiomycetes（锤舌菌纲）相对丰度在处理B中增加，Dothideomycetes（座囊菌纲）相对丰度在处理A、B、C、D中增加，Mortierellomycetes（被孢霉纲）相对丰度在处理A、B、C中增加，Saccharomycetes（酵母纲）相对丰度在处理A和B中增加。处理B的Eurotiomycetes（散囊菌纲）、Agaricomycetes（伞菌纲）、Geminibasidiomycetes（双担菌纲）、Leotiomycetes（锤舌菌纲）相对丰度最高分别为18.32%、3.97%、1.29%、0.68%，处理C的Pezizomycetes（盘菌纲）相对丰度最高为28.05%，CK的Sordariomycetes（粪壳菌纲）相对丰度最高为73.17%。

在属水平上的土壤真菌群落结构组成表明（图2），排前十的优势菌属分别为：Morchella（羊肚菌属）、Penicillium（青霉菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）、Scedosporium（丝饱菌属）、Chrysosporium（金孢子菌属）、Geminibasidium（双担菌属）、Fusarium（镰刀菌属）、Chaetomium（毛壳菌属）、Bjerkandera（烟管菌属）、Acremonium（支顶孢属），其5个处理的平均相对丰度分别为43.76%、5.78%、5.01%、4.93%、4.07%、2.60%、1.53%、0.83%、0.44%、0.27%。Morchella（羊肚菌属）相对丰度在处理C和D中增加，Aspergillus（曲霉菌属）相对丰度在处理A、B、D中增加，Scedosporium（丝饱菌属）、Acremonium（支顶孢属）相对丰度在处理A中增加，Geminibasidium（双担菌属）、Bjerkandera（烟管菌属）相对丰度在处理B中增加，Fusarium（镰刀菌属）相对丰度在处理C中增加。处理A的Scedosporium（丝饱菌属）相对丰度最高为9.25%，处理B的Aspergillus（曲霉菌属）、Geminibasidium（双担菌属）、Bjerkandera（烟管菌属）相对丰度最高分别为7.67%、4.40%、2.17%，处理C的Morchella（羊肚菌属）、Fusarium（镰刀菌属）相对丰度最高分别为62.87%、3.69%，CK的Penicillium（青霉菌属）、Chrysosporium（金孢子菌属）、Chaetomium（毛壳菌属）、Acremonium（支顶孢属）相对丰度最高分别为11.25%、5.13%、1.24%、0.90%。

2.3 PCA主成分分析

利用PCA主成分分析对各处理OTU组成进行分析并作图（图3）。通过分析不同样本OTU组成可以反映样本间的差异和距离，样本在图中的距离越远，其组成差异越大。由图3可知，PC1的贡献率为27.01%，PC2的贡献率为25.07%。处理A分布在第1象限，处理B分布在第4象限，处理D分布在第2象限，处理C和CK分布在第3象限。处理A、B、D与CK分布在不同象限，且图中距离较远，表明其物种组成与CK存在差异。

2.4 镰刀菌属相对丰度

镰刀菌属包含很多对甜瓜具有致病力的病原菌，探究镰刀菌属相对丰度的变化情况可以评估不同菌剂的处理效果。对不同处理的镰刀菌属相对丰度进行作图（图4）可知，不同的微生物菌剂处理对镰刀菌属相对丰度的影响不一样。与CK相比，处理D和A的镰刀菌属相对丰度分别为0.42%和1.81%，分别比CK低0.14%和1.53%，其中处理D的镰刀菌属相对丰度最低;处理C和B的镰刀菌属相对丰度高于CK，分别为4.32%和1.92%，其中处理C的镰刀菌属相对丰度最高。表明处理D具有降低镰刀菌属相对丰度的效果，能减少镰刀菌属群落数量;处理A对镰刀菌属有一定的抑制效果，但较为有限。

3 讨论与结论

在土壤真菌群落Alpha多样性分析中，CK的Chao1指数和observed species指数最大，分别为309.41和280.00，表明在使用微生物菌剂后，土壤真菌群落物种的数量呈下降趋势。处理B和A的Shannon指数、Simpson指数高于CK，处理D、C的Simpson指数高于CK，表明菌剂处理后，土壤真菌群落均匀度得到提高，真菌多样性优于CK，其中处理B和A的效果最为明显。综合比较发现，施用微生物菌剂可以降低土壤真菌群落物种数量，真菌丰富度有所降低，但可以提高土壤真菌群落物种的均匀度，真菌多样性优于未施用微生物菌剂的CK。这与胡可等[18]的研究结果一致。

在土壤样品物种分类构成及丰度分析中，优势种群相对丰度在不同处理间存在差异。在纲水平上的土壤真菌群落结构组成表明，排前十的优势菌纲分别为：Sordariomycetes（粪壳菌纲）、Pezizomycetes（盘菌纲）、Eurotiomycetes（散囊菌纲）、Agaricomycetes（伞菌纲）、Geminibasidiomycetes（双担菌纲）、Leotiomycetes（锤舌菌纲）、Lecanoromycetes（茶渍纲）、Dothideomycetes（座囊菌纲）、Mortierellomycetes（被孢霉纲）、Saccharomycetes（酵母纲）。在属水平上的土壤真菌群落结构组成表明，排前十的优势菌属分别为：Morchella（羊肚菌属）、Penicillium（青霉菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）、Scedosporium（丝饱菌属）、Chrysosporium（金孢子菌属）、Geminibasidium（双担菌属）、Fusarium（镰刀菌属）、Chaetomium（毛壳菌属）、Bjerkandera（烟管菌属）、Acremonium（支顶孢属）。在PCA主成分分析中，处理A、B、D与CK相比分布在不同象限，且图中距离较远，表明菌剂处理后土壤样品的物种构成发生了变化。

在镰刀菌属相对丰度分析中，处理D和A的镰刀菌属相对丰度低于CK，分别为0.42%和1.81%，其中处理D的镰刀菌属相对丰度较CK低1.53%。表明处理D（新型菌剂NBmelon）具有降低镰刀菌属相对丰度的效果，能减少镰刀菌属群落数量，在一定程度上有利于减少枯萎病、根腐病、果腐病等鐮刀菌属病害的发生。

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