鱼腥草联合亚胺培南对碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌杀菌效果的体外研究

黄秋兰，钱巧慧，范德平，刘红绸，薛娜丽，高守霞，马莹玮，周嘉平

(1.上海市嘉定区南翔医院a.检验科;b.中医科，上海 201802；2.上海健康医学院附属周浦医院教学培训部，上海 201318)

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是目前院内感染的最重要条件致病菌之一，随着临床碳青霉烯类药物的广泛应用，耐碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（carbapenem-resistantpseudomonas aeruginosa，CRPA）逐年增多，相关感染患者的死亡率呈逐年上升趋势[1]。近年世界卫生组织（WHO）报告也指出耐碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌已是最致命的病原菌之一，临床为控制相关感染迫切需要合理使用有效的抗生素和治疗方法[2-4]。

但是现有抗CRPA 感染药物，如抗菌肽、铁鳌合物等，均未广泛应用于临床，同时新型抗生素研发也需要一个长期的过程。中医药治疗临床感染性疾病已历史久远，目前有近百种较为常用的抗菌中草药。鱼腥草味辛，性微寒，可清热解毒、消痈排脓、利尿通淋，既往多用于治疗肺痈吐脓、痰热喘咳等。现代科学研究表明鱼腥草含有抑菌成分，具有抑菌作用，可用于治疗呼吸道感染、结膜炎等炎症性疾病[5-6]。本研究旨在分析鱼腥草联合亚胺培南对CRPA 的体外杀菌效果，为合理使用抗生素、预防和控制医院感染提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 从2018年1月～2020年3月上海市某医院收治的患者采集痰、尿、创面等液体标本，对分离到的50 株CRPA 进行研究，所有菌株均经Vitek2Compact 全自动细菌鉴定药敏仪（生物梅里埃公司，法国）鉴定，剔除来源同一患者的重复菌株。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器：Vitek2Compact，酶标仪（SMMk3），微量移液器，生物安全柜，96 孔平底组织培养板，电子分析天平。

1.2.2 试剂：①注射用亚胺培南-西司他丁钠（默沙东公司，批号:S041089，规格：亚胺培南500mg和西司他丁钠500mg/瓶）。将蒸馏水作为溶剂，无菌条件下配置128U/ml 亚胺培南原液，即每瓶注射用亚胺培南西司他丁钠用1 953.13ml 无菌注射用水溶解，并贮存于4℃冰箱中备用。②鱼腥草标准品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度99.8%，批号：6858，规格：20mg/瓶）。无菌操作下用无菌注射用水作溶剂，配制1 024μg/ml 的鱼腥草原液。

1.2.3 CRPA 悬液的制备：使用液体培养法制备，在基础琼脂培养基的平板上对CRPA 传代2～3 次，确保其保持良好的生长状态。使用接种环在无菌条件下取一环菌落，将其接种在4～5ml 的MH 肉汤培养液内，恒温培养箱内培养4～6h（35℃）。使用生理盐水校正浓度至0.5 麦氏比浊标准，将悬液进行1:100 稀释，15min 内接种，此时含菌量约为

1.5 ×106CFU/ml。

1.3 方法

1.3.1 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定：50 株CRPA 使用微量肉汤稀释法测定MIC 值，将鱼腥草素钠原液及亚胺培南原液使用试管倍比稀释法制备成一系列的浓度稀释液。制备菌悬液，50μl/孔进行接种，同时设置阴性与阳性对照。做3 个重复，恒温培养箱内培养16～18h 后观察，无细菌生长且孔内澄清即为MIC。

1.3.2 联合抑菌效应判断：通过棋盘稀释法测定分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）指数。分别以两药MIC 的2 倍为最高稀释浓度，按试管倍比稀释法纵横加25μl 入无菌96 孔板内，每孔中可得到不同浓度组合的两种抗生素混合液。再制备CRPA 悬液，在15 min 内将制备好的菌液每孔50μl 加入孔内，此时每孔最终接种菌量约为5×105CFU/ml，设置药物单独抗菌试验对照、阴性对照和阳性对照，置35℃培养16 ～18h 后观察结果。试验重复3 次。孔内澄清无细菌生长的最低药物浓度，使用棋盘稀释法测试并计算FIC 指数，由联合MIC 和单测MIC 应用公式计算FIC 指数：FIC 指数＝A 药联合时的MIC/A 药单测MIC ＋B药联合时的MIC/B 药单测MIC。并依据以下标准来判断两药联合的抗菌作用：IC 指数＜0.5 为协同作用；0.5 ～1 为相加作用；1～2 为无相关作用；＞2为拮抗作用。

1.3.3 浮游菌时间杀菌曲线：随机选取2 株敏感菌株，在含有1×109CFU/L 浮游菌的肉汤内加入鱼腥草、亚胺培南或鱼腥草及亚胺培南，其终浓度分别为16,4 和2mg/L，并设置空白对照组，37℃下振荡培养。在各时间点分别取样100μl 进行平板菌落计数。杀菌效应：24h 时细菌数量降低≥6log CFU/L。

1.4 统计学分析 采用WHONET 6.0 软件和SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计数资料采用率（%）表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 亚胺培南、鱼腥草单用与联用对CRPA 的MIC 见表1。对50 株CRPA 进行测定，亚胺培南单用的MIC50和MIC90均高于鱼腥草单用及亚胺培南和鱼腥草联合使用，且鱼腥草单用的MIC50和MIC90均高于亚胺培南和鱼腥草联合使用。

表1 亚胺培南、鱼腥草单用和联用对CRPA 的MIC（mg/L）

2.2 亚胺培南和鱼腥草联用对CRPA 的FIC 50 株测试菌株，其中12（24.0%）菌株亚胺培南和鱼腥草联用后FIC 结果为＜0.5，呈现协同作用；30 株（60.0%）FIC 结果为0.5～1.0，表现为相加作用；8株（16.0%）FIC 结果为1.0～2.0，表现为无相关作用；未发现有菌株FIC 结果表现为拮抗作用。

2.3 亚胺培南、鱼腥草单用和联用对浮游菌的时间杀菌曲线 随机选取2 株菌株观察，发现24h 后浮游菌数量均＜6log CFU/L，提示无杀菌效果。单独使用亚胺培南6～12h 后，菌株均出现细菌恢复生长的现象。鱼腥草联合亚胺培南使用时，菌株的浮游菌数量降低均＞6log CFU/L，且24h 时均无细菌生长现象，见图1。

图1 亚胺培南、鱼腥草单用和联用对CRPA 浮游菌的时间杀菌曲线

3 讨论

PA 极易出现耐药，且耐药机制十分复杂，即使部分菌株是初次分离的敏感菌株，在用抗生素治疗3～4 天后即可发生耐药[7-8]。临床分离到的CRPA菌株，往往同时对氨基苷类、氟喹诺酮类以及β-内酰胺类等抗生素耐药，尽管多黏菌素可能是目前对CRPA 最为有效的抗生素之一，但是其毒副作用大，临床较少使用；替加环素是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染的首选，但对CRPA 无抗菌活性。新型抗生素的研发是克服CRPA 耐药性的有效途径，但新药开发周期长、投资大，短期内也无新药可用于临床抗感染治疗。

中医药治疗临床感染性疾病已历史久远，目前有近百种较为常用的抗菌中草药，因而从中草药中去筛选对铜绿假单胞菌具有较强抗菌活性的药物或相关成分可能有助于CRPA 感染的治疗。近年有研究通过筛查12 种中药对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性，进一步发现鱼腥草具有体外抑制铜绿假单胞菌的活性[9]。然而CRPA 具有广泛耐药的特性，单一的中药抑制其活性作用有限，本研究旨在分析亚胺培南作为临床一线用药抗多重耐药PA 感染理论基础上，联合鱼腥草在体外抗CRPA 的活性。研究结果显示亚胺培南单用的MIC 均高于鱼腥草单用及亚胺培南和鱼腥草联合使用，且鱼腥草单用的MIC50和MIC90均高于亚胺培南和鱼腥草联合使用。通过对CPRA 的MIC 值分析，本研究同时也证明鱼腥草对CRPA 具有一定的抑菌活性。

为进一步分析鱼腥草和亚胺培南体外联合抑菌效应，本研究通过棋盘稀释法测定分级抑菌浓度对50 株CRPA 进行了检测。结果发现鱼腥草和亚胺培南联用后，测试菌株主要呈现协同作用和相加作用，未发现有菌株FIC 结果表现为拮抗作用。已有研究发现由于中药药性平和，毒副作用小且不易产生耐药性，与西药联用可增强疗效[10]。基于该研究理论，本研究结论也进一步显示鱼腥草和亚胺培南联用可增强CRPA 的抑菌效率。

为从时间维度验证鱼腥草和亚胺培南对CRPA的体外抑菌效率，本研究最后通过随机选取2 株菌株观察对浮游菌的时间杀菌曲线。结果发现单独使用亚胺培南6～12h 后，菌株均出现细菌恢复生长的现象，而鱼腥草联合亚胺培南使用时，菌株的浮游菌数量明显降低，且24h 时无细菌生长现象。该结果进一步说明了鱼腥草联合亚胺培南抗PA 时较不易发生耐药，具有较佳的协同抗菌作用。

对于鱼腥草抑制铜绿假单胞菌作用机制，包括抑制LasA 蛋白酶的活性[11]、调控细胞因子mRNA的表达[12]以及消除生物膜的屏障[13]等，本研究并未在分子水平进行相关标志物表达的检测，同时鱼腥草的体外抑菌效率有待在动物水平进一步验证。