脓性渗出物中老兵诺卡菌的分离鉴定及文献复习

邵玲，吴小利，翟明贺，刘丽文（辽宁省人民医院检验医学科，沈阳110016）

诺卡菌（Nocardia）广泛存在于土壤、灰尘、腐烂的植被、动物粪便沉积物以及水环境中［1］，并作为一种机会致病菌，可引起免疫功能受损患者的感染，尤其是呼吸道感染［2］。目前诺卡菌属包括100多个菌种［3］，其中有接近30个菌种与人类感染有关，包括脓肿诺卡菌（N.abscessus）、非洲诺卡菌（N.africana）、星形诺卡菌（N.asteroides）、巴西诺卡菌（N.brasiliensis）等［2］。随着分子鉴定技术的快速发展，很多少见或新命名的诺卡菌菌种逐渐被人们发现。老兵诺卡菌（N.veterana）就是其中之一，该菌于2001年从一位78岁患者的支气管镜灌洗液中分离并获命名［4］。目前全球关于人类感染老兵诺卡菌的病例报道已有20多例，而我国仅台湾地区有1例报道［5］。目前，诺卡菌的鉴定多采用16SrRNA、secA1、hsp65、gyrA和rpoB等基因为基础的分子生物学方法［6］。近年来，随着质谱技术的发展以及诺卡菌参考数据库的扩增，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）亦可用于老兵诺卡菌的鉴定。本文报道从1例诊断为横纹肌溶解症患者患肢膝盖后侧脓性渗出物中分离得到1株老兵诺卡菌，对该菌的微生物学特征、鉴定及药物敏感性进行分析，并结合文献复习，为临床实验室检出该菌提供参考并加强临床对于该菌感染的重视。

1 材料与方法

1.1 研究对象及菌株来源 菌株分离自一位55岁男性横纹肌溶解症患者患肢膝盖后侧脓性渗出物，患者合并2型糖尿病并有类固醇激素使用史。患者入院第2天至第26天膝盖后侧持续有脓性渗出物，无臭味，白细胞计数处于持续升高状态，最高可达17.58×109/L，分别在第2天及第10天取脓性渗出物进行一般细菌培养，检出老兵诺卡菌。质控菌株大肠埃希菌ATCC 35218购自上海宝录生物公司。

1.2 主要仪器及试剂 LEICA DM750光学显微镜（德国LEICA公司）；microflexTMLRF质谱分析仪及CHCA基质液（Bruker Daltonics公司）；血琼脂培养基（中国彦程公司）；革兰染色液（快速）、抗酸染色液（快速）（珠海贝索公司）；DL-96STAPH试剂盒（珠海迪尔公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒（天根公司）；EasyTaq PCR SuperMix聚合酶（北京全式金公司）；磁珠法DNA凝胶回收试剂盒（上海硕美公司）；引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.3 分离菌的培养与形态观察 将分离菌株接种在血平板上35℃培养0～120 h，取培养24～120 h菌落制片后革兰染色观察；分别取培养48 h菌落制片后，参照快速抗酸染色试剂说明书并略改良进行弱抗酸染色：石碳酸复红染色10 min，2 mol/L H2SO4分别脱色2 s、10 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s，亚甲蓝染色2 min观察镜下形态。重复2次。

1.4 MALDI-TOF MS鉴定 挑取血平板上培养48 h单个菌落涂在靶板上，自然干燥后加入1μL 70%甲酸，待完全干燥后，加入1μL CHCA基质液，待完全干燥后，置于质谱仪上进行鉴定并依据仪器说明书进行结果判读。

1.5 16SrRNA基因序列分析 收集单个菌落，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。参照文献［7］合成细菌16SrRNA引物，序列分别为：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系为30μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 15μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，H2O 11μL。PCR反应条件：94℃5 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，25个循环；72℃7 min。PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳并采用磁珠法DNA凝胶回收试剂盒对目的条带进行回收，采用Sanger法在ABI 3730XL设备上进行测序，测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。测序后将序列和GenBank数据库进行BLAST比对。并下载与待测菌相似度大于98.0%的菌种的各个基因序列，其中每个菌种选取相似度最高的1个菌株，用MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.6 生化反应及药物敏感性分析 选取血平板培养48 h单个菌落，制备0.5麦氏浊度单位菌悬液，在DL-96STAPH生化反应板孔中每孔加入菌悬液100μL，生化反应包括D-氨基葡萄糖、脲酶、麦芽糖、β-半乳糖苷酶、七叶苷、棉子糖，VP、硝酸盐；取50μL 0.5麦氏浊度单位菌悬液加入DL-96STAPH试剂盒中的M-H肉汤培养基中，充分混匀并分别取上述含菌液M-H肉汤培养基100μL加入含抗菌药物试验孔，35℃孵育72 h，依据DL-96STAPH试剂盒说明书以及美国临床和实验室标准协会（CLSI）M62文件［8］进行结果判读。同时采用大肠埃希菌ATCC 35218作为质控菌株。

1.7 文献复习 使用PubMed、中国知网（CNKI）对老兵诺卡菌感染的相关文献进行检索，检索范围为2001年1月至2020年3月以前发表的文献，英文关键词为“Nocardia veterana”，中文关键词为“老兵诺卡菌”，语言限制为英文和中文，对检索的文献进行审查，排除人类感染以外的文献以及对诺卡菌属感染的汇总分析文献。

2 结果

2.1 分离菌的培养特性、菌落形态及镜下形态 分离菌株在血平板上35℃可缓慢生长，24 h呈较小白色干燥颗粒状菌落，48～72 h后形成干燥白色菌落，菌落有褶皱现象（图1），且有泥土气味。镜下为革兰阳性丝状菌，培养24 h镜下呈分枝状（图2A），48～96 h分枝逐渐断裂（图2B、2C、2D），120 h后分枝完全消失（图2E）。弱抗酸染色呈弱抗酸性（图2F）。

图1 老兵诺卡菌在血平板上菌落形态（35℃培养24～72 h）

图2 革兰染色及弱抗酸染色镜下形态

2.2 生化反应及MALDI-TOF MS鉴定 MALDI-TOF MS鉴定为老兵诺卡菌（得分为2.245）。分离菌35℃培养48 h后，D-氨基葡萄糖、脲酶、麦芽糖、β-半乳糖苷酶、七叶苷阳性，棉子糖、VP、硝酸盐阴性。

2.3 16S rRNA基因序列分析结果 PCR扩增产物Sanger法测序长度为1 385 bp，将测序序列和GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示分离菌与数据库中的Nocardia veterana（登录号：NR_115156.1）序列相似性达100%。以Streptomyces gardneri strain NBRC 3385为外类群，通过MEGA7.0软件构建系统进化树，发现分离菌与N.veterana DSM4445在同一分支上，属于同一菌种，老兵诺卡菌与克露茨克氏诺卡菌（N.kruczakiae）亲缘关系较近。见图3。

图3 基于16SrRNA基因序列和运用Neighbor-Joining的方法构建的系统发育树

2.4 药物敏感试验 分离菌对抗菌药物的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）分别为阿米卡星（0.25μg/mL）、庆大霉素（1μg/mL）、克拉霉素（0.25μg/mL）、利奈唑胺（≤2μg/mL）、复方磺胺甲噁唑（1/19μg/mL）、环丙沙星（8μg/mL）。其中，分离菌对环丙沙星耐药，其余抗菌药物均敏感。

2.5 文献资料 共纳入13篇文献，英文为13篇，中文为0篇，病例数为16例［4-5，9-20］。16例感染病例中大部分来源于欧美地区（11/16），2例来自澳大利亚，3例来自亚洲地区（日本2例，中国台湾地区1例）；感染部位多见于肺部（8/16），还可引起脑、肠道、尿道、腹膜及淋巴管感染甚至菌血症，以及1例足分支菌病及1例眼部感染。鉴定方法大部分采用16SrRNA测序，有2例采用MALDI-TOF MS与16SrRNA测序相结合，经过适当治疗，有11例效果良好。见表1。

表1 老兵诺卡菌感染文献复习

续表

3 讨论

本文对临床分离老兵诺卡菌进行24～120 h培养后的镜下观察，发现该菌可以形成明显分枝状菌丝，分枝在48～96 h易断裂，120 h后几乎全部断裂，与文献中星形诺卡菌镜下形态相似［21］。本文分离老兵诺卡菌具有弱抗酸特点。诺卡菌弱抗酸染色的结果与脱色时间有关［21］，本文采用脱色时间在2～60 s时，弱抗酸染色为阳性，＞60 s显示为阴性，因此在对诺卡菌进行弱抗酸染色时，要控制脱色时间，以免产生假阴性结果。有研究显示，老兵诺卡菌七叶苷反应为阳性，而非洲诺卡菌为阴性；非洲诺卡菌棉子糖反应为阳性，老兵诺卡菌为阴性［11］，但是由于生化反应特异性较弱，且诺卡菌种类繁多，仅通过生化反应难以实现菌种鉴定。

本文采用的MALDI-TOF MS参考数据库包括星形诺卡菌（N.asteroides）、非洲诺卡菌（N.africana）、巴西诺卡菌（N.brasiliensis）、老兵诺卡菌（N.veterana）等35种诺卡菌。MALDI-TOF MS蛋白质处理方法有2种，分别是直接涂布法和蛋白质提取法，蛋白质提取法可提高鉴定的准确性［22］。由于分离菌生长较为缓慢，依据文献［23］，本文采用幼龄菌进行鉴定。目前基因测序已经成为鉴定诺卡菌最准确的方法，现有文献报道老兵诺卡菌的鉴定大多采用16SrRNA测序。当有些诺卡菌菌种间序列相似性较高时，可以增加其他管家基因如secA1、hsp65、gyrA和rpoB或构建系统进化树增加鉴定可信度。本文采用MALDI-TOF MS与16SrRNA测序的方法同时鉴定出分离菌为老兵诺卡菌，另外系统进化树结果显示分离菌与N.veterana DSM4445在同一分支上，属于同一菌种。

文献复习发现，16例老兵诺卡菌感染的病例中除了肺部感染（8/16），还可引起脑、肠道、尿道、腹膜、淋巴管感染甚至菌血症，以及足分支菌病及眼部感染等浅表感染，因此，老兵诺卡菌引起的感染范围较为广泛。而易感人群大多存在明确的免疫力受损因素，如使用免疫抑制剂治疗、HIV感染以及患有系统性红斑狼疮等疾病，虽然有2例无明确的免疫抑制状态，但仍伴随有糖尿病或支气管扩张等基础疾病。本文患者患有2型糖尿病且有类固醇使用史，亦存在易感因素。由于国际上对于老兵诺卡菌的治疗尚无统一方案，文献报道大部分采用复方磺胺甲噁唑成功治愈，其治疗剂量从160 mg/800 mg～320 mg/1 600 mg不等，治疗期限为3个月至1年，需要根据患者的症状及免疫状态而定。而复方磺胺甲噁唑与阿米卡星、碳青霉烯或头孢曲松的组合常用于严重或全身感染［24］。本例患者分离菌对复方磺胺甲噁唑敏感，治疗中联合应用了复方磺胺甲噁唑和头孢他啶，但由于患者基础疾病较重，最终死亡，未能对其药效进行评估。利奈唑胺是一种新型唑烷酮类抗生素，2003年Moylett等［25］首次报道了6例用利奈唑胺治疗成功的诺卡菌感染患者。因此，对于老兵诺卡菌感染的患者，可选用复方磺胺甲噁唑，对于磺胺类药物不耐受者，可选择利奈唑胺进行治疗。

综上，本文对老兵诺卡菌的形态、鉴定及药敏试验进行描述，为临床实验室对该菌的识别提供可视化参考；同时总结了国内外相关报道及治疗经验，为临床治疗提供用药参考。