下调SOAT1表达对食管癌增殖和转移的影响

宁光耀，张仁泉，黄云龙

食管癌是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，具有病死率高、男性多于女性等特点，其发病率和病死率均呈上升趋势。尽管许多影响食管癌发生发展的危险因素已被证实，但其具体的机制尚未阐明。甾醇氧乙酰基转移酶(sterol O-acyltransferase，SOAT)-1可催化细胞内游离胆固醇转换成胆固醇脂类，并维持细胞内的胆固醇稳态。哺乳动物体内SOAT包含2个亚型：SOAT1和SOAT2，SOAT1是内质网的标记酶，广泛表达于所有组织类型，而SOAT2仅在肠道和肝脏中表达。研究发现，SOAT1在多种肿瘤中的影响已被报道，其中包括肝细胞癌、肾透明细胞癌以及结肠腺癌。然而，目前尚无报道阐明SOAT1在食道鳞状细胞癌中的作用。因此，该研究主要从细胞学实验阐明SOAT1异常表达对食管癌细胞的增殖、迁移及侵袭的调节作用，为今后的临床治疗提供一定的基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

细胞株

选用的食管癌细胞株(KYSE 510、KYSE 450、KYSE 150和KYSE 30)和食道上皮细胞(Het-1a)均购自中国科学院细胞库。

1.1.2

主要试剂和仪器

RPMI Medium 1640 basic培养基(美国Gibco公司)，无支原体新生牛血清(杭州四季青有限公司)，Lipofectamine 2000转染试剂(美国ThermoFisher公司)，Transwell小室(美国Corning生物科技有限公司)，Cell Counting Kit -8(上海碧云天生物技术有限公司)，超敏ECL化学发光试剂盒(美国ThermoFisher公司)，SOAT1抗体(美国Abcam公司)，GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记二抗(北京中杉金桥公司)，Annexin V-FITC/PI双染色试剂盒(美国BD Biosciences公司)，Takara 逆转录试剂盒、Real Time PCR试剂盒(北京Takara生物医学公司)。2条SOAT1特异性siRNA均由上海吉玛生物科技有限公司合成，靶序列分别为：CCCACUCAUUUGUCAGAGA，CUCUUCAUGUUCUUUGGAA。酶标仪(美国Bio-Tek公司)，流式细胞仪(美国BD生物科学有限公司)，化学发光图像分析系统(上海天能科技公司)。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养

采用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基，细胞培养箱的培养条件为5% CO、37 ℃。

1.2.2

siRNA干扰

当KYSE 30细胞处于生长指数期时，在6孔板中进行接种。待细胞生长至70%～80%时，按照《lipofectamine 2000操作说明书》进行siRNA转染。分别取100 pmol /ml siRNA和3 μl lipofectamine 2000加入到2支含100 μl Opti-MEM培养基的1.5 ml离心管中混匀室温放置5 min，将2支离心管内液体混匀室温放置15 min，最后分别均匀加入到每个培养孔内。

1.2.3

细胞增殖检测

在96孔板中接种KYSE30细胞，密度为5 000个/孔。经不同处理后，加入10 μl CCK-8溶液并混匀，继续培养1.5 h后采用酶标仪检测吸光度值。

1.2.4

划痕实验

当KYSE30细胞处于生长指数期时，按1×10个/ml的密度在6孔板中接种。24 h后换成含1%胎牛血清的RPMI 1640培养基，继续培养12 h。采用200 μl 枪头在培养孔底部划出水平划痕，并用PBS洗去漂浮细胞，用含1%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养。置于光学显微镜下拍照，经过不同转染处理后，48 h再次进行拍照。

1.2.5

Transwell实验

首先制备预铺Matrigel胶的transwell小室，Matrigel胶和RPMI 1640培养基的比例为6 ∶1。选取经siRNA转染48 h的细胞，调整细胞密度为1×10个/ ml。在上室内加入100 μl 细胞悬液，下室内加入600 μl 含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，继续培养48 h。取出小室，放入4% 多聚甲醛溶液中室温固定20 min，PBS洗涤后放入1%结晶紫染色缸内进行染色15 min，PBS洗涤后置于室温干燥，擦去小室内膜上Matrigel胶和染色细胞，最后在显微镜下拍照。

1.2.6

流式细胞术

将KYSE 30细胞接种于6孔板中，分成对照(NC)组和siRNA-2组，观察细胞凋亡情况。继续培养48 h后，使用Annexin V-FITC/PI双染色试剂盒对收集的细胞进行染色。用流式细胞仪检测细胞凋亡，用Flow-jo软件分析细胞凋亡情况。

1.2.7

Western

blot

组织或细胞采用含1% PMSF的RIPA裂解液进行裂解5 min后，在4 ℃环境下进行14 000 r/min离心。取清亮的上清液，并采用BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行蛋白定量。取30 μg 蛋白液依次进行SDS-PAGE浓缩、分离并转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗(1 ∶1 000)，在4 ℃条件下孵育过夜。洗涤3次后，加入二抗，室温孵育1 h，洗涤后在化学发光图像分析系统进行拍照。

1.2.8

mRNA提取与qRT

-

PCR

采用AxyPrep总RNA小量制备试剂盒(美国Axygen公司)进行RNA提取。然后，采用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA。最后，采用Real Time PCR试剂盒进行相对定量检测。SOAT1引物序列：F: TTTGCTGACGCTGCTGTAGAACC，R：AAAGGCTTCATTTACTTCCCACATTGC；GAPDH引物购于上海生工生物工程有限公司。

2 结果

2.1 食管癌组织中SOAT1蛋白及mRNA表达高于癌旁正常组织

收集9例食管癌患者的临床资料及组织样本。患者平均年龄为58～75(67.5±6.6)岁，其中男性6例，女性3例。术后病理诊断报告均为食道鳞状细胞癌，其中低分化5例、中低分化3例、高分化1例。食管癌组织中SOAT1蛋白的表达高于癌旁组织(图1A)，且SOAT1 mRNA 表达亦高于癌旁正常组织(图1B)，差异有统计学意义(

t

=4.162，

P

=0.000 7)。

图1 食管癌患者的配对癌及癌旁组织中SOAT1蛋白及mRNA表达水平

2.2 食管癌细胞系中SOAT1蛋白及mRNA表达高于食管正常上皮细胞

选取4株食管癌细胞系以及Het-1a。如图2A示，SOAT1蛋白在4株食管癌细胞系内表达均不同程度高于Het-1a细胞。如图2B示，4株食管癌细胞系内SOAT1 mRNA表达亦均高于Het-1a细胞且差异有统计学意义(

F

=85.72，

P

<0.000 1)。

图2 SOAT1蛋白及mRNA在食管癌细胞及食道上皮细胞中的相对表达量

2.3 siRNA敲低KYSE30细胞内SOAT1蛋白及mRNA表达

如图2所示，KYSE30细胞系内SOAT1蛋白及mRNA表达相对较高，因此后续细胞学实验均采用KYSE30细胞系。如图3所示，通过细胞转染siRNA敲低细胞内SOAT1表达，结果显示，与NC组比较，2条SOAT1特异性的siRNA-1/2均可以下调KYSE30细胞内SOAT1蛋白(图3A)及mRNA(图3B)表达且差异有统计学意义(

F

=42.80，

P

=0.000 3)。同时，本研究选取siRNA-2继续开展功能学实验。

图3 转染siRNA后KYSE30细胞内SOAT1蛋白及mRNA表达

2.4 降低SOAT1表达可减慢KYSE30细胞的增殖能力，增加细胞凋亡比例，促进凋亡相关蛋白表达

如图4A示，降低SOAT1表达可抑制KYSE30细胞的生长速度，差异有统计学意义(72 h：

t

=5.573，

P

=0.005 1；96 h：

t

=10.73，

P

=0.000 4)；如图4C示，负向调节SOAT1表达可增加KYSE30细胞的凋亡比例(0.62%

vs

6.49%)；Western blot结果也证实，敲低SOAT1表达促进了凋亡蛋白cleaved PARP和cleaved caspase-3的表达(图4B)。

图4 敲低SOAT1表达对KYSE30细胞增殖、凋亡细胞比例以及凋亡相关蛋白表达的影响 A：2组细胞增殖变化；B：2组细胞内凋亡相关蛋白表达水平；C：2组细胞内凋亡比率变化；与NC组比较：**P<0.01，***P<0.001

图5 下调KYSE30细胞内SOAT1表达对其迁移及侵袭的影响×100

2.5 下调SOAT1表达可减弱KYSE30细胞的迁移和侵袭性

如图5A、B所示，与NC组比较， SOAT1低表达组KYSE30细胞的迁移数目减少且差异有统计学意义(

t

=9.923，

P

=0.000 6)。如图5C、D示， SOAT1低表达组KYSE30细胞的侵袭能力较NC组减弱(

t

=3.357，

P

=0.028 4)。

3 讨论

正常细胞向恶性肿瘤细胞转化包括体细胞突变、表观遗传改变、代谢重编程和细胞生长失控。其中代谢重编程已成为肿瘤生物学的研究热点，关键代谢基因也成为癌症发生发展中重要调控因子和潜在的治疗靶点。SOAT1是一种变构酶，它可以利用多种甾醇(包括氧甾醇和植物甾醇等)作为底物和活化剂，其中胆固醇是最优的底物和活化剂。近年来，研究发现SOAT1不仅参与生酮途径、异亮氨酸降解和解酮过程而且具有调控肿瘤增殖及耐药的能力。研究发现，SOAT1是前列腺癌的潜在预后标志物之一，前列腺癌样本中出现胆甾醇酯积累，体内动物模型证实降低SOAT1介导的胆甾醇酯积累可以抑制前列腺癌的生长和转移。Martinez-Outschoorn et al发现在MDA - MB - 231细胞中上调SOAT1基因，可显著提高乳腺癌的生长和转移能力。与此同时，在结直肠癌和肺癌中，SOAT1亦可促进癌细胞的增殖以及转移。

为探究SOAT1对食管癌是否具有同样调控作用，本研究收集了新鲜的食管癌组织，与正常食道组织比较，癌灶中SOAT1蛋白和mRNA表达上升。接下来，敲低SOAT1表达可以减慢食管癌细胞的增殖速度，促进其凋亡，并抑制其迁移及转移能力，这与Geng et al研究结果类似。然而，在肾细胞癌中，SOAT1相对低表达组患者具有更短的总生存期和无病生存期，且体外实验发现过表达SOAT1基因抑制肾癌细胞的生长及迁移能力。本研究与Geng et al的研究结果相反，这有可能与纳入实验的细胞系类型有关。盐酸Nevanimibe是SOAT1的抑制剂之一，体外实验显示，低剂量可抑制降低肾上腺激素生成，高剂量可引起肾上腺皮质细胞凋亡。一项包含63例肾上腺皮质癌患者的多中心的临床I期试验发现，盐酸Nevanimibe的最大耐受安全计量为6 000 mg/75 kg，但是研究中尚未发现任何完全缓解或部分缓解的迹象。因此，对于盐酸Nevanimibe是否在食管癌临床中具备安全性和有效性将值得进一步探究。综上所述，敲低SOAT1表达可负向调控食管癌细胞增殖、迁移以及侵袭能力，这为今后的SOAT1抑制剂临床治疗提供了一定理论依据。