基于微宇宙系统的四溴双酚A生态危害评估研究*

汪 贞 范德玲 周林军 古 文 葛海虹 朱 伟

(1.生态环境部南京环境科学研究所，江苏 南京 210042；2.生态环境部固体废物与化学品管理技术中心，北京 100029)

生态危害评估是定性和(或)定量评估生物体、系统或(亚)种群暴露于化学物质中的潜在危害性，是化学品生态风险评估的首要任务。生态危害评估包括基于单一物种和基于生态系统两种尺度的研究[1]。物种敏感度分布曲线(SSD)法是基于单一物种毒性测试数据的生态危害评估方法之一，被广泛用于推导化学物质的环境质量基准。水生微宇宙技术是一种通过人工构建、模拟水生态系统组成和过程的试验模型，通过开展毒性测试进而评估外源物质进入水生环境后的归趋和对生物的危害。早在20世纪初，很多学者开始对微宇宙系统开展一系列研究，分析不同营养级生产者、消费者和分解者的关系，生物丰度和理化性质联系，种间竞争和生物多样性等，微宇宙技术已成为欧美等发达国家化学品高层次生态风险评估的重要方式之一。

四溴双酚A是一种大量生产并广泛应用的溴化阻燃剂，据统计，每年有约12万t四溴双酚A及其衍生物为市场所需[2]，占总溴化阻燃剂市场的60%左右[3]。四溴双酚A虽然能以共价键的形式结合聚合物且不易溶于水，但是未结合的部分很容易释放到生态环境中[4]。我国环渤海地区、长江流域、云南洱海、珠江三角洲等水域均有四溴双酚A检出，个别水域检出质量浓度甚至高达4.77 μg/L[5-8]。四溴双酚A对水生生物存在毒性并具有迁移性、持久性和蓄积性等特点[9-10]，会对环境造成长久的污染，更可能通过食物链的生物富集性和生物放大作用扩散到整个生态系统中。国内目前缺乏含有四溴双酚A的水质标准，因此针对四溴双酚A的综合生态风险评估难以进行。

本研究通过构建标准化微宇宙系统试验模拟真实的生态环境来评估四溴双酚A在水生环境中的生态风险。通过微宇宙系统试验得到四溴双酚A的无显著效应浓度(NOEC)，并与采用SSD法[11]推导出的四溴双酚A在水环境中的预测无效应浓度(PNEC)进行对比，探索两种生态危害评估方法的差异性，这对于提高我国化学品危害评估的系统性和科学性具有参考价值，也为我国开展不同层次的四溴双酚A环境危害评估提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

Agilent 1290型高效液相色谱(美国Agilent公司)，QTRAP 4500型质谱(美国AB公司)，DM2500型光学显微镜(德国Leica公司)，DR2800型分光光度计(美国哈希公司)，HQ 40d型多参数水质分析仪(美国哈希公司)，2100Q型便携式浊度分析仪。

四溴双酚A(分析纯)，纤维素(生物试剂级)，几丁质(生物试剂级)。试验用到的轮虫培养基配制参考文献[12]，T82MV培养基配制参考文献[13]，鲁哥氏液配制参考文献[14]。

1.2 供试生物

试验用的6种藻类，包括小球藻(Chlorella)、四尾栅藻(Scenedesmusquadricauda)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)和镰形纤维藻(Ankistrodesmusfalcatus)，均购自中国科学院淡水藻种库；萼花臂尾轮虫(Brachionuscalyciflorus)从南京师范大学引入；中华新米虾(Neocaridinadenticulatasinensis)购自南京本地市场；大型溞(Daphniamagna)由本实验室培养。所有生物培养方法均参考文献[12]。

1.3 微宇宙试验方法

参照美国材料实验协会(ASTM)的微宇宙技术导则开展为期63 d的微宇宙试验[13]。在体积5 L的烧杯中装入200 g石英砂、0.5 g纤维素、0.5 g几丁质和3 L T82MV培养基以构建标准化微宇宙系统。实验室温度维持在20～22 ℃，光照约为3 000 lux，明暗周期为12 h∶12 h。试验第0天加入6种藻类，每种藻类初始细胞浓度为104个/mL，第4天加入大型溞16只、萼花臂尾轮虫90只和中华新米虾12只。试验第7天，根据溶解氧(DO)、pH、大型溞数量等指标剔除差异较大的微宇宙系统，向稳定的微宇宙系统中分别加入80.00、400.00、2 000.00、10 000.00 μg/L四溴双酚A，同时设置空白对照组(ck组)，每个处理做6个平行取平均值。

试验第7天开始，每周两次测定微宇宙系统pH、叶绿素a和物种丰度等参数，四溴双酚A浓度每周测定1次。DO每周测定2次，每次测定记录3次DO数据，分别为早上光周期开始前、下午光周期结束前以及第2天光周期开始前，计算微宇宙系统光合作用产氧量以及呼吸作用耗氧量，计算式分别见式(1)、式(2)。试验期间每周向微宇宙系统加入轮虫培养液1滴(约0.05 mL)、6种藻的混合液10 mL(每种藻的接种细胞浓度均为104个/mL)以补充取样损失，根据需要加入大型溞和中华新米虾使其在每个微宇宙系统内的数量保持在3只以上。当某物种全部死亡后，不再另行补充。

P=DO2-DO1

(1)

R=DO2-DO3

(2)

式中：P为微宇宙系统光合作用产氧量，mg/L；R为微宇宙系统呼吸作用耗氧量，mg/L；DO1、DO2、DO3分别为早上光周期开始前、下午光周期结束前以及第2天光周期开始前微宇宙系统的DO质量浓度，mg/L。

1.4 分析方法

水质指标：DO、pH采用哈希HQ 40d型多参数水质分析仪测定；叶绿素a采用分光光度法测定；浊度采用浊度分析仪测定。

物种丰度：中华新米虾、大型溞丰度采用抽样肉眼计数；取搅拌均匀的微宇宙水样用鲁哥氏液固定，在显微镜下用浮游生物计数板对萼花臂尾轮虫、藻类进行计数。

四溴双酚A浓度测定：取10 mL水样离心后取其上清液过0.45 μm滤膜，采用高效液相色谱串联质谱进行测定[15]。

1.5 数据处理

根据试验期间四溴双酚A浓度变化，采用时间加权计算微宇宙系统四溴双酚A平均暴露浓度[16]；物种丰度数据和理化指标数据进行对数转化后，用单因素方差分析和Dunnett’s检验确定空白对照组与处理组差异的显著性。引起显著性差异的浓度为最低可观察效应浓度(LOEC)，比LOEC小的上一级浓度视为无显著效应浓度(NOEC)，最后以各采样时间点的最敏感NOEC作为系统整体水平的NOEC。

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析与差异显著性检验。

2 结果与讨论

2.1 微宇宙系统中的水质参数

2.1.1 四溴双酚A在微宇宙系统中的暴露浓度

由于四溴双酚A在水中的溶解度较低，微宇宙系统中浮游植物和悬浮颗粒物能有效吸附疏水性四溴双酚A，浮游动物也能通过消化道和体表对其进行吸收，加上其自身的可降解性，试验期间四溴双酚A处理组的暴露浓度均逐渐减小(见图1)，通过对初始质量浓度为80.00、400.00、2 000.00、10 000.00 μg/L的四溴双酚A进行时间加权平均运算，得到微宇宙系统水体中四溴双酚A的平均质量浓度分别为10.80、55.11、259.42、1 356.61 μg/L，下文中四溴双酚A在微宇宙系统中暴露浓度均用时间加权平均浓度表示。

图1 微宇宙系统中四溴双酚A变化趋势Fig.1 Trend of tetrabromobisphenol A measured in microcosms

2.1.2 微宇宙系统中DO和pH的变化

试验过程中，微宇宙系统光合作用产氧量、呼吸作用耗氧量、光合呼吸比率(P/R)及pH变化见图2。显著性分析结果表明，各四溴双酚A处理组及与ck组之间的光合作用产氧量、呼吸作用耗氧量均无明显差异，第30天时，各微宇宙系统的呼吸作用耗氧量均达到最低值，此后一周内，呼吸作用耗氧量又逐渐回升。光合呼吸比率可用于评价微宇宙系统能量流动方向，本研究构建的微宇宙系统光合呼吸比率基本保持在1以下，说明系统内呼吸作用耗氧量大于光合作用产氧量，能量大多向较高营养级的大型溞、萼花臂尾轮虫及中华新米虾方向流动。

图2 微宇宙DO和pH变化Fig.2 Dynamics of DO and pH in microcosms

pH可以反映微宇宙系统内生态系统种群的代谢情况。试验过程中，各微宇宙系统的pH均在6.5～9.5波动，显著性分析结果表明，4个四溴双酚A处理组与ck组的pH没有显著性差异，表明四溴双酚A没有显著扰乱微宇宙系统中生物种群的正常代谢。

2.1.3 微宇宙系统浊度和叶绿素a的变化

微宇宙系统浊度与叶绿素a的变化见图3。浊度可以反映微宇宙系统水体中颗粒物含量，与藻细胞浓度以及各种生物的代谢产物浓度有关。试验中各微宇宙系统的浊度变化趋势相近，统计分析结果表明，四溴双酚A处理组与ck组的浊度没有显著性差异。叶绿素a反映了微宇宙系统内藻类生物量的变化。试验前28天，各微宇宙系统的叶绿素a变化幅度较小，28 d后叶绿素a变化幅度较大。统计分析结果表明，除个别暴露时间点外，四溴双酚A处理组与ck组的叶绿素a没有显著性差异。

图3 微宇宙系统浊度和叶绿素a的变化Fig.3 Dynamics of turbidity and chlorophyll a in microcosms

2.2 微宇宙系统中物种丰度的变化

2.2.1 浮游动物丰度变化

微宇宙系统浮游动物丰度变化见图4。由图4(a)可见，四溴双酚A处理组的大型溞丰度变化与ck组总体比较相似，且大型溞丰度与四溴双酚A的暴露浓度没有明显的相关性，高浓度暴露组(259.42、1 356.61 μg/L)大型溞丰度在28 d后均高于低浓度暴露组(10.80、55.11 μg/L)及ck组，这可能与中华新米虾丰度变化有关。数据显著性分析结果也表明，四溴双酚A处理组与ck组大型溞丰度变化没有显著差异。

由图4(b)可知，试验第4～28天，各微宇宙系统中的萼花臂尾轮虫丰度均处于较低水平，28 d后，ck组萼花臂尾轮虫丰度开始逐渐升高，四溴双酚A处理组的萼花臂尾轮虫丰度在试验第49～63天均显著下降。总体看来，萼花臂尾轮虫丰度并未随四溴双酚A暴露浓度的升高而出现规律性变化。

图4 微宇宙系统大型溞、萼花臂尾轮虫以及中华新米虾的丰度变化Fig.4 Changes of daphnia,rotifer and shrimp abundances in microcosms

由图4(c)可知，四溴双酚A处理组中华新米虾丰度急剧减少，在试验第7～14天一直处于下降趋势，第38～63天，中华新米虾丰度基本稳定。微宇宙系统的中华新米虾丰度变化存在明显的剂量-效应关系，四溴双酚A暴露浓度越高，中华新米虾受到的影响越大，死亡率越高。

2.2.2 浮游植物丰度变化

微宇宙系统总藻丰度变化见图5。由图5可见，试验第0～7天所有微宇宙系统的总藻丰度均呈指数增长，随后总藻丰度在生态系统中的捕食者和四溴双酚A的相互作用下呈现波动变化。试验后期(第49～63天)，各微宇宙系统的总藻丰度均有不同程度的下降，这可能与大型溞和中华新米虾的种群丰度稳定有关。四溴双酚A处理组与ck组相比，总藻丰度没有显著差异。

图5 微宇宙系统总藻丰度变化Fig.5 Changes of total algae species abundances in microcosms

2.3 微宇宙系统对四溴双酚A的生态危害综合评估

参照ASTM的微宇宙技术导则，以不同物种的丰度以及理化指标作为生态危害效应的终点，对四溴双酚A处理组和ck组在不同暴露时间点的物种丰度和理化指标进行显性方差分析，结果见表1。整个微宇宙系统存在一条4个营养级的食物链(藻类-萼花臂尾轮虫-大型溞-中华新米虾)，其中中华新米虾作为顶级捕食者在暴露初期(14～28 d)的LOEC一直维持最高水平(1 356.61 μg/L)，与ck组相比，中华新米虾丰度显著下降，说明四溴双酚A的毒性作用是影响中华新米虾丰度的关键因素。在不同暴露时间点、不同四溴双酚A暴露浓度下，大型溞丰度与ck组均未出现显著差异，说明大型溞受四溴双酚A毒性影响较小。此外，高pH可能减少四溴双酚A对大型溞的毒性[17]。萼花臂尾轮虫的丰度变化与大型溞和中华新米虾均不相同，具体表现在LOEC在第49～56天维持在55.11 μg/L，在此阶段四溴双酚A处理组的中华新米虾、大型溞丰度与ck组相比均未发生显著增减，萼花臂尾轮虫丰度却出现显著下降，这可能是微宇宙系统试验后期四溴双酚A浓度降低促使大型溞丰度回升，影响了萼花臂尾轮虫种群恢复，在试验第63天LOEC下降至10.80 μg/L，表明四溴双酚A的生物毒性也会导致萼花臂尾轮虫丰度显著减少。藻类作为生产者也受到类似的捕食压力，试验第7天四溴双酚A处理组藻类丰度与ck组没有显著差异。四尾栅藻、羊角月牙藻和镰形纤维藻均为藻类中的优势种群且对四溴双酚A的暴露具有较高抗性，所以在各暴露时间结点均未观测到与ck组的显著差异，优势种群的主导地位使得其余藻类的变化不明显。当大型溞和中华新米虾种群处于稳定期，羊角月牙藻丰度出现显著下降，羊角月牙藻在第42、56天的LOEC为259.42 μg/L，可能是受到捕食胁迫作用导致。总藻丰度在不同暴露时间点、不同四溴双酚A暴露浓度下与ck组间差异均不显著，表明四溴双酚A化学暴露对藻类的影响较小。叶绿素a受到藻类丰度影响明显，但叶绿素a在试验第21天的LOEC为1 356.61 μg/L，叶绿素a浓度显著升高，这可能是由于捕食者大量减少导致，后续试验期间各四溴双酚A处理组的叶绿素a均未出现连续的显著变化，因此认为叶绿素a受藻类丰度和捕食者压力的共同作用影响。

表1 物种丰度以及理化指标在不同暴露时间点的LOEC1)

从理化指标来看，由于微宇宙系统的稳定性，pH在整个试验过程中均保持在稳定的水平，说明微宇宙系统内部化学变化较小。pH在多营养级系统比单一营养级系统的波动小[18]，说明生物的多样性(浮游动物和植物)对水体的pH有一定的缓冲作用。P/R在第42天的LOEC为1 356.61 μg/L，P/R显著下降，说明微宇宙系统中藻类作为生产者其光合作用产氧量不及消费者(大型溞、萼花臂尾轮虫和中华新米虾等浮游动物)的呼吸耗氧量，但是从整个试验周期来看，未发生两个或两个以上连续暴露时间的P/R显著变化，可见四溴双酚A作为外源污染物没有明显干扰微宇宙系统种群间的能量交换。

文献[11]利用SSD法推导出的四溴双酚A的PNEC为42.9 μg/L。本研究根据微宇宙系统试验各指标的综合评估，得出四溴双酚A在7～56 d的NOEC为10.80 μg/L，63 d的NOEC低于10.80 μg/L。与基于单物种毒性试验得出的PNEC(42.9 μg/L)相比低约75%。可见，根据SSD法估算出的生态风险值与模拟生态环境下实际NOEC值存在较大的差距。

水生态危害评估方法中，微宇宙系统和基于单一物种的SSD法所估算出的生态危害浓度并不存在简单的外推关系[12]。微宇宙系统试验能提供SSD法所不能实现的物种间关系的代谢变化、暴露于化学物质的内部水环境和物质间的因果关系等信息，但仍存在可重复性差和庞杂数据合理分析不足等弊端。利用微宇宙系统的方法估计四溴双酚A的生态危害性，通过不同营养级构成的小型生态系统实现区域或整个生态系统的危害评估，直观地反映生态系统内各因子相互作用的结果，可以对基于SSD法所估算出四溴双酚A的PNEC进行互补与对比，为四溴双酚A水质标准制定提供数据支持。

3 结 论

(1) 四溴双酚A微宇宙系统中，pH基本保持稳定，没有显著性变化，P/R值总体小于1。四溴双酚A的化学暴露是影响中华新米虾丰度的关键因素，但其对藻类、大型溞、萼花臂尾轮虫的影响不显著。

(2) 通过对微宇宙系统中物种丰度，系统理化指标等的观察分析，得到微宇宙系统7～56 d的NOEC为10.80 μg/L，63 d的NOEC低于10.80 μg/L，低于基于单物种毒性试验得出的PNEC(42.9 μg/L)，产生差异的原因可能是微宇宙系统的种间竞争和各营养级在不同介质中的交互作用的影响。

(3) 利用微宇宙系统评估四溴双酚A的生态危害性，通过不同营养级构成的小型生态系统能够更直观地反映生态系统内各因子相互作用的结果，为四溴双酚A水质标准制定提供数据支持。