基于酶辅助目标物循环及金属有机框架材料的电化学链霉素传感器

陈颖，高宇

长江大学化学与环境工程学院, 湖北 荆州 434023

抗生素是由微生物自然产生或人为合成的一类化学物质，其抗菌性能被广泛应用于治疗细菌感染，并在农业中作为生长促进剂添加到动物饲料中[1,2]。但是，不当使用抗生素或长期间接摄入食源性抗生素残留物，可能会导致抗生素在体内的积累，甚至产生一些具有抗菌耐药性的超级细菌，严重威胁人类健康[3]，如过量使用氨基糖苷类抗生素之一的链霉素(streptomycin, STR)会导致听觉神经和肾脏损害等毒副作用[4]。因此，发展有效的抗生素检测方法已成为迫切需求。

传统的抗生素检测方法主要是有生物法、高效液相色谱、气-质联用、液-质联用等[5-9]，这些方法尽管较准确，但也存在大多具有样品前处理繁琐、检测时间长、成本高、仪器价格昂贵、需要专技人员维护等局限性。为了适应抗生素检测发展的需求，一批基于比色、电化学、电致化学发光、荧光等传感器检测方法应运而生[10]。其中，电化学由于具有灵敏度高、响应快、选择性好、操作简便且成本低等优点而备受关注，并在抗生素的检测中得到了一定应用[11]。

灵敏度的提高是传感器研究的一大关键问题，具体的实现途径主要可归为纳米材料和生物放大策略的使用。金属-有机框架材料(MOF)是近年来新兴的一类由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的有机-无机杂化材料。这种材料具有多孔性、大的比表面积及结构功能的可调控性，有望实现在分析检测中的应用[12]。目前，一般将功能化MOF用作目标物识别元件或信号分子的固载基质，修饰于电极表面，实现目标物的识别和信号的转导及放大输出[12-16]。但这通常需要复杂的修饰过程，操作较繁琐。如何才能在不增加额外修饰步骤的前提下，简单地产生基于MOF的电化学信号呢?已有研究表明，MOF(UiO-66)具有吸附单链DNA(ssDNA)的能力[17-19]，如果利用该MOF直接修饰电极，通过吸附电活性分子标记的ssDNA，就可简单地实现电化学信号的输出。此外，作为生物放大策略之一的目标物循环，一般是利用核酸酶的催化作用释放被捕获的目标物，使得目标物循环参与分子识别过程，达到n倍放大信号的目的。为了进一步降低检测出限，在传感器的构建中还可联用两种甚至多种信号放大策略，达到检测信号的级联放大效果。

适体(aptamer, Apt)是用配体指数富集法系统演化(SELEX)技术筛选得到的一段能与靶分子特异性结合的寡核苷酸序列，具有靶分子范围广、亲和力高、特异性强、稳定性好、易于获取等优点。为此，笔者构建了一种基于酶辅助目标物循环信号放大策略和MOF修饰电极的高灵敏电化学适体传感器，并应用于定量检测以STR为模型目标物的抗生素。STR与磁珠表面DNA双链杂交体(dsDNA)中的适体链结合，形成3’端暴露的Apt-STR复合物，引发在核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)辅助下Apt-STR复合物中Apt的降解作用，释放出STR循环参与生物识别过程[20]。由于Apt与STR的结合使得Apt从dsDNA中移除并释放出标记了二茂铁的信号探针(Fc-SP)，在酶辅助目标物循环作用下，少量STR即可从磁珠表面去除大量适体，继而释放出大量Fc-SP，吸附于MOF修饰电极表面。通过对电极表面的Fc-SP进行电化学检测，从而实现STR的定量分析。由于酶辅助目标物循环的高效信号放大能力，磁珠易于分离富集的优点，及MOF修饰电极优良的电化学性能和易操作性，该方法有望构建灵敏高效简单的抗生素传感器，实现对STR的准确分析。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

氯化锆(ZrCl4),Aladdin化学试剂有限公司；2-氨基对苯二甲酸，Macklin生化科技有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇，锡龙化工有限公司。Tris-HCl、巯基己醇(MCH)，Sigma-Aldrich公司；核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)，New England Biolab公司。一次性印刷碳电极(SPCE)由碳工作电极(直径3mm)、碳对电极和银参比电极组成，Zensor R&D有限公司。杂交缓冲溶液(HB)由10mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl 及 1mmol/L MgCl2(pH=7.4)组成。羧基磁珠偶联试剂盒(包含羧基化磁珠MB-COOH、活化液、偶联液、封闭液、储存液、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(sulfo-NHS)),试验所用DNA订购于生工生物工程技术服务有限公司，其序列如下：

链霉素适体(STR Apt)：5’-GGGGTCTGTTCTGCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’适体互补链(NH2-cDNA)：5’-ACGACCCGACAGAACAAAGCAGCAGAACAGACCCC-(CH2)6-NH2-3’标记二茂的铁信号探针(Fc-SP)：5’-Fc-(CH2)6-CGGCGCATGCGTCGACCTGCAG-3试验过程中使用超纯水经雷磁超纯水过滤净化系统得到。电化学循环伏安法(CV)及方波伏安法(SWV)在CHI660E电化学工作站上操作完成。采用JEM2100F透射电子显微镜和布鲁克D8 Advance x射线衍射仪表征所制备的UiO-66-NH2材料。

1.2 MOF(UiO-66-NH2)材料的合成

采用溶剂热法合成了UiO-66-NH2MOF材料，步骤如下：首先，将0.2399g ZrCl4和0.1819g 2-氨基对苯二甲酸分散在50mL DMF中。充分搅拌后，将该混合物转移到100mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在120℃下加热反应48h，然后自然冷却至室温。离心收集产物，用DMF/CH3OH彻底洗涤。最后，在90℃条件下干燥12h，即可得到UiO-66-NH2粉末。

1.3 MB-dsDNA共轭物的制备

将等物质的量的STR Apt、NH2-cDNA与Fc-SP混合于杂交缓冲液中至三者最终浓度分别为2×10-6mol/L，将所得溶液水浴加热至90℃保持5min，再缓慢降至室温，整个降温过程至少1h，形成具有- -NH2和- -Fc末端的DNA双链体(dsDNA)。接着利用羧基磁珠偶联试剂盒，通过dsDNA的- -NH2与MB-COOH发生酰胺化反应，将dsDNA固定于MB表面，制备MB-dsDNA共轭物。具体步骤简述如下：首先，将100μL MB-COOH(50μg/μL)洗涤3次后分散于含有5mg的EDC和5mg的sulfo-NHS 的活化缓冲溶液中，摇床上温育30min活化羧基。磁性分离上清液后，将活化后的MB-COOH (5μg/μL)与上述含有- -NH2末端dsDNA的偶联缓冲液混匀，置于摇床上在室温条件下温育90min，以完成酰胺化反应。随后，磁性分离，弃去上清液，收集MB-dsDNA共轭物，向其中加入1mL封闭液，室温下温育30min。最后，将制备的MB-dsDNA共轭物洗涤并再次分散于1mL储备液中，4℃条件下保存备用。

1.4 STR传感器的构建

将SPCE置于20mmol/L Tis-HCl缓冲液(pH=7.4)中，设置电位范围为-0.6～0.6V、扫速0.5V/s，进行电化学CV扫描直至伏安图稳定为止，取出SPCE冲洗并用氮气吹干。将上述预处理好的SPCE浸入铁氰化钾溶液中扫描表征裸电极表面的电化学行为。SPCE冲洗吹干后，立即向碳工作电极区域滴加10μL制备好的MOF悬浊液(1mg/mL)，室温晾干，使得碳工作电极表面形成一层均匀的MOF膜。以MB-dsDNA共轭物(1μg/μL)作为电化学探针，与含不同质量浓度STR和Exo Ⅰ(200U/mL)的PBS溶液(0.1mol/L，含0.1mol/L的KCl，pH=7.4)在37℃条件下温育30min，完成目标物STR诱导在Exo Ⅰ作用下Apt的降解，释放出Fc-SP。磁性分离后收集上清液，并分别与MOF/SPCE温育2h。随后采用SWV在10mmol/L PBS溶液中检测对应电极吸附Fc-SP所得电流强度。SWV检测参数设置如下：电位扫描范围为-0.2～0.6V，频率为25Hz，振幅为25mV。

2 STR检测原理

设计了一种基于酶辅助目标物循环和MOF修饰电极的灵敏简单电化学适体传感器，实现了以STR为模型目标物的抗生素分析，具体原理如图1所示。首先，将3种不同的DNA(STR Apt、NH2-cDNA、Fc-SP)退火杂交，形成具有氨基和二茂铁修饰末端的DNA双链体(NH2-dsDNA-Fc)，再通过酰胺化反应将NH2-dsDNA-Fc修饰于MB-COOH表面，制备具有分子识别功能和电化学信号标签的MB-dsDNA共轭物。当STR不存在时，Exo Ⅰ无法降解组装于MB表面的dsDNA。一旦STR存在，它与固定于MB-dsDNA中的STR Apt结合，形成3’端暴露的Apt-STR复合物，致使dsDNA解旋，释放出Apt和Fc-SP。含有3’端暴露适体的Apt-STR复合物激活Exo Ⅰ催化降解STR Apt，释放出STR。释放出的STR可再次与固定于MB表面的适体结合并在Exo Ⅰ作用下再次释放，如此循环，即使少量的STR也能导致大量MB表面适体的移除，随之释放出大量Fc-SP。释放出的Fc-SP与目标物STR质量浓度成正相关，通过MOF修饰电极将释放出的Fc-SP吸附于电极表面实现电化学信号输出。由于目标物STR质量浓度越高，释放出的信号分子Fc-SP越多。电流强度随着目标物STR质量浓度的增加而递增，以此作为定量分析依据。由于Exo Ⅰ辅助目标物循环的信号放大能力、MOF材料对信号探针的高效吸附及信号输出能力，以及操作过程的便捷性，该方法有望实现简单灵敏的STR分析。

图1 电化学生物传感器检测STR的原理示意图Fig.1 Schematic illustration of the electrochemical biosensor for STR detection

3 结果与讨论

3.1 UiO-66-NH2的表征

采用TEM对合成的MOF材料(UiO-66-NH2)进行了形貌表征。图2(a)显示所制备材料呈现出均匀的颗粒形貌，平均直径约为60～80nm，这与之前研究报道结果一致[14,21]。图2(b) 为材料XRD表征，所得XRD图谱也与之前文献结果相符[14]。综合TEM和XRD表征结果均表明了UiO-66-NH2的成功制备。

图2 UiO-66-NH2的表征Fig.2 Characterization of UiO-66-NH2

3.2 传感器制备过程的电化学表征及可行性分析

以[Fe(CN)6]3-/4-为氧化还原指示剂，采用循环伏安法研究了不同电极表面的电化学行为，如图3(a)所示。从图3(a)可以看出，裸SPCE呈现出一对可逆性良好的氧化还原特征峰(曲线a)。修饰上一层MOF之后，MOF/SPCE产生的峰电流强度略有下降(曲线b对比曲线a)，这是由于UiO-66-NH2与绝大多数MOF一样导电性较差造成的。将定量的MB-dsDNA共轭物与含有不同质量浓度STR和定量Exo Ⅰ的PBS溶液温育后，磁性分离收集上清液。收集的上清液再温育MOF/SPCE，所得峰电流强度呈现出进一步下降的现象(曲线c)。这是由DNA负电荷磷酸盐骨架与负电性[Fe(CN)6]3-/4-之间的排斥作用及空间位阻效应所导致。以上结果表明DNA在MOF/SPCE表面的成功吸附，说明了传感界面的成功制备，也初步反映了目标物STR能够诱导MB-dsDNA共轭物释放出ssDNA(Fc-SP)。

为了进一步评估传感器构建的可行性，研究了不同电极对应的SWV响应曲线，如图3(b)所示。在无STR存在时，MOF/SPCE与反应上清液温育后，未观察到峰电流(曲线a)，此为空白对照实验的背景响应信号。然而，当MOF/SPCE与STR(5ng/mL)存在时的反应上清液温育后，产生了明显的峰电流(曲线b对比a)，其峰电位与Fc氧化还原峰电位相当，这意味着目标物STR成功诱导MB-dsDNA解旋，释放出Fc-SP并吸附于MOF/SPCE表面。因此，只有STR的存在才能导致固定于磁珠表面的dsDNA解旋释放出信号探针Fc-SP，作为STR的定量分析依据，否则，STR诱导信号探针的释放及其吸附都处于禁阻状态。该结果再次证明了所构建传感器应用于STR检测的可行性。

注：a为裸SPCE，b为MOF/SPCE，c为MOF/SPCE温育STR反应上清液。图3 电极逐步修饰过程的电化学表征Fig.3 Electrochemical characterization of the stepwise modified SPCE

3.3 灵敏性

对不同目标物质量浓度分别进行了检测并记录数据，通过峰电流强度与对应STR质量浓度的关系评估了该方法的灵敏度。图4(a)记录了不同STR质量浓度所对应的SWV响应信号。在目标物STR不存在的空白对照试验中，未观察到明显的峰电流(曲线a)。当STR存在时，对应的SWV响应信号呈现出峰电流(曲线b至h)，并且随着STR质量浓度的增加，检测到对应于Fc的峰电流强度也相应增加。这是由于高质量浓度的STR可以使得固定于磁珠表面的dsDNA在Exo Ⅰ辅助下释放出更多Fc-SP，吸附于MOF/SPCE表面，获取电流强度剧烈增加的SWV信号。如图4(b)所示，响应电流强度与STR质量浓度的对数值在0.3～150ng/mL范围内呈线性关系，并估算出检出限(LOD)约为0.2ng/mL。由于适体与目标物STR的特异性识别作用、Exo Ⅰ酶辅助目标物循环高效的信号放大能力及MOF/SPCE在信号分辨和放大方面的优越性能，该方案相较于其他检测方法而言[22-24]，显现出相当甚至更高的灵敏度以及较宽的检测范围。

注：曲线a至h分别对应STR质量浓度为0、0.3、0.5、1、2、5、20、150ng/mL。图4 目标传感器的灵敏度评估Fig.4 Sensitivity evaluation of target biosensor

3.4 选择性

为了评估传感器对STR测定的选择性，分别选取氯霉素(CAP)、卡那霉素(KAN)和土霉素(OTC)3种抗生素作为干扰物进行测定。如图5所示，相同质量浓度(20ng/mL)的CAP、KAN和OTC对应的SWV检测响应信号与空白试验相比差异不大。然而，即使对较低质量浓度(2ng/mL)STR的测定，也得到了显著的信号增量。这表明只有STR才能导致SPCE表面适体DNA链的去除，从而释放出Fc-SP吸附于MOF/SPCE表面，产生信号。此外，使用STR和非目标物抗生素的混合物进行了交叉干扰实验：与STR的单独检测相比，混合物的存在也没有引发峰值电流强度的明显变化。这表明即使在共存条件下非目标抗生素对STR也几乎没有干扰效应。结果表明，该方法具有良好的选择性。

图5 目标传感器的选择性评估 Fig.5 Selectivity evaluation of target biosensor

3.5 实际样品中STR的检测

通过对从湖北省荆州市当地超市获得的牛奶样品进行加标回收试验，研究了该方法测定复杂样品中STR的可行性。将牛奶样品高速离心，经微孔膜(0.22μm)过滤后，稀释10倍，未检测出STR。加入不同质量浓度的STR进行加标回收试验，3种样品的回收率分别为105%、98.2%和104%。该结果表明了传感器具有实现复杂样品中STR检测的应用潜力。

4 结论

1)基于酶辅助目标物循环的高效信号放大能力及MOF修饰电极优良的电化学性能，笔者构建了一种灵敏高效简单的抗生素适体传感器。

2)该传感器对STR的检测具有较宽的线性范围(0.3～150ng/mL)、低至0.2ng/mL的检出限、良好的选择性，并可用于实际牛奶样品中的STR检测。

3)该方法具有有效灵敏检测抗生素STR的能力，为食品分析领域提供方法学支撑，为公共卫生安全提供一定程度的技术支持。