绣球果实的形态及石蜡切片解剖结构特征

张文波，王亚静，苏 晨，董 燕，候倩茹，耿腾飞

(西安市农业技术推广中心，西安 710061)

绣球(Hydrangeamacrophylla)属绣球科绣球属多年生亚灌木、灌木或小乔木状珍贵木本花卉[1]，又名山绣球、八仙花、紫阳花，原产于我国，主要分布于华东、华中、云南、广西等地区，具有花大、花色艳丽、花期长、观赏价值高等特点。喜温暖、湿润、散射光或半阴环境，生长适温为18～28 ℃，超过30 ℃时会出现不良影响。1789年，Joseph Banks把绣球从中国引入英国以后，立即成为世界各国备受欢迎的园艺观赏植物[2]。全世界绣球属大约有73个种，中国有47个种和11个变种[3]，在这些品种中缺乏抗强光照及抗热性表现好的品种，限制了绣球花在园林方面的应用。国内近几年对绣球花杂交育种的研究越来越多，但是绣球花的杂交种子存在一定程度的胚败育现象，导致杂交种子萌发率低，影响了育种进程。作者试图通过建立石蜡切片关键技术，进一步了解绣球花种子发生发育过程，为研究胚败育机理奠定基础，加快育种进程，以增大园林绿化花卉种类的选择和利用。

石蜡切片是一种非常经典的显微制片方法，由于其易操作、切片薄、能够形成连续蜡带等优点，广泛应用于比较解剖学、发育解剖学、生理解剖学等。目前绣球花果实石蜡切片的制作技术尚不明确。因此，本研究拟探索绣球花果实的一般石蜡制片流程，以期为绣球花果实石蜡制片技术提供参考,以便借助切片能更直观地观察种子发育情况。

1 材料与方法

1.1 实验时间、地点

采样时间为2019年12月16日，实验于2020年1月中旬至2月在西安市现代农业科技展示中心实验室进行。

1.2 实验材料

在西安市现代农业科技展示中心花卉种植棚剪取生长174 d的绣球花果实。

1.3 实验方法

1.3.1 绣球果实及种子形态特征的观察 选取典型的绣球花果实30粒，用OLYMPUS SZX16体视显微镜观察果实的外形，利用游标卡尺测量其大小并记录。

1.3.2 绣球果实石蜡切片及观察

(1)固定

向2 ml离心管中分别加入1 mL FAA固定液(70%乙醇90 mL、冰醋酸5 mL、甲醛5 mL)，固定3 d。

(2)脱水、透明

固定后的材料依次在75%、85%、90%、95%乙醇以及两次无水乙醇中脱水4、2、2、1 h，30、30 min，然后在1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液、100%二甲苯、100%二甲苯中分别逐级透明10 min。

(3)浸蜡与包埋

在放置有材料及二甲苯的小瓶中加入1/4体积的碎蜡，将其置于38 ℃恒温箱中浸蜡；12 h后温度设置为48 ℃，并用一次性塑料滴管吸出1/4体积混合液，继而再加入1/4体积的纯净石蜡；再经12 h温度设置为58 ℃，同样吸出1/4体积混合液，再加入1/4体积的纯净石蜡，重复2次，每次12 h。最后转入30 mL陶瓷蜡杯，换3次纯净液体石蜡，每次渗蜡3 h。依包埋材料数量将A4纸裁成适宜大小后叠成包埋盒，用自来水稍微蘸湿包埋盒底部后，倒入融化的石蜡进行包埋。

(4)切片、粘片与烤片

将蜡块修成立方体粘于小木块后切片，切片厚度为4 μm。切片漂浮于摊片机40 ℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60 ℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

(5)脱蜡与染色

将烘干的切片依次放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，纯水洗。将脱蜡复水后的切片放入1%番红染色液中染色2 h，自来水稍洗，洗去多余染料即可。切片依次放入50%、70%、80%梯度酒精中各3～8 s进行脱色。将切片放入固绿染色液中染色6～20 s，无水乙醇三缸脱水。切片入干净的二甲苯透明5 min，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。

2 结果

从图1A看到果实表面光滑且呈黄绿色圆锥形，在其顶端有四个柱头，花托整个包裹着果实，花托表面有纵向微突起的果棱。果实长径3.02～5.24 mm，短径2.10～3.72 mm，厚度为2.27～3.52 mm。从图1B看到种子外形似葵花子仁，细长、顶端稍尖，还具有不规则的网状纹理。

图1 绣球果实及种子的形态

从图2看到试验所制切片形态和结构完整，图像干净清晰。从制片中可以观察到果实主要由外果皮、果肉、内果皮及种子组成，果实最外侧是一层排列紧密的外果皮表皮细胞，局部表皮细胞木栓化被染成红褐色，表皮向内为膨大的果肉薄壁细胞，果肉中分布有维管束，维管束中的木质部被染成红色，韧皮部被染成蓝绿色。内果皮有两层木质化的细胞组成，从切片可以看到种子呈细长形，种皮细胞木质化被染成鲜红色，种子紧挨着两侧内果皮分散排列。

图2 绣球果实的石蜡切片(纵切)

3 讨论

生产上，绣球采用扦插扩繁，这种方式周期短且能保持母株优良性状，但是绣球易患病毒病，如果扦插母株患病，容易造成病毒病的积累传播，且病毒目前无有效防治方法。采用种子扩繁就可避免病毒病的积累，因此有必要对绣球花果实进行解剖观察和鉴定，以掌握种子的发育规律，这对绣球花的生产具有重要现实意义。

从生长了170 d的果实来看，种皮已木质化，且大部分种子已经从胎座上脱落下来，说明种子已经接近成熟期。一般胚败育发生在种子发育的中后期，所以我们可以通过石蜡切片观察，以判定种子发育的时期，尽早制定胚拯救方案。另外，从授粉到果实成熟，果实和种子在发育过程中的完整形态变化还需要我们通过进一步的分阶段采样，以精确判定种子的发育时期，为胚拯救奠定基础。

众所周知，果实中分布有维管系统，维管束是果实水分和营养物质运输的主要通道,在种子发育期间,水分、无机盐和有机物等物质通过维管系统, 从果实胎座被输送到胚乳和胚, 供胚乳和胚发育与贮藏。胚败育是否与维管系统有关，这还需要我们进一步对果实发育过程中的维管系统进行解剖分析。