抑菌放线菌筛选鉴定及其发酵条件和发酵产物稳定性的研究

晏爱芬 余 丽 司红艳 韦胡侦

（保山学院 资源环境学院，云南 保山 678000）

抗生素(antibiotics)是由各种微生物或高等动植物在其生命活动过程中所产生的一类次级代谢产物[1]，具有抗病原体或干扰其他生活细胞发育功能的作用。其中大家最为熟知的就有链霉素(Streptomycin)、杀稻瘟菌素（Blasticidin）、多抗霉素（Polyoxin）和井冈霉素（Validamycin）等。链霉素是从一种灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的发酵液中提取的抗菌素，对植物细菌病害的防治效果较好，被广泛用来防治蔬菜、花卉和果树栽培的病害[2]；杀稻瘟菌素[3]是一种肽基核苷抗生素，由灰色链霉菌(Streptomyces griseus)代谢产生，主要通过干扰细胞核糖体中肽键的形成来抑制蛋白质的生物合成，在农业生产中被大量应用于水稻稻热病的防治；多抗霉素[4]是由金色链霉菌（Streptomyces aureus）代谢所产生的抗生素，属于广谱性杀菌剂；井冈霉素[5]是由吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代谢所产生的抗真菌剂，能够防治水稻病原真菌水稻纹枯病菌（Rhi⁃zoctonia solani）感染所引起的纹枯病害。

放线菌是与人类生产和生活关系密不可分的一类革兰氏阳性细菌，当前使用的抗生素约占70%由各类放线菌产生而来。除抗生素外，部分放线菌还能代谢产生各种酶制剂[6]、维生素和有机酸等。海洋、湖泊、土壤、动植物体内，甚至极端环境中都能找到放线菌的踪迹，其中土壤中的放线菌含量最高、种类最多。刘晓飞等[7]从黑龙江黑土中分离筛选到产蓝色素的放线菌，能抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长；李菲等[8]从广西茅尾海红树林自然保护区土壤中共分离到444株放线菌，筛选出具有功能酶活性的菌株56株。高黎贡山丰富多样的地貌类型为放线菌的筛选提供了更多的便利。本研究从高黎贡山国家级自然保护区百花岭采集土壤，采用富集培养和划线分离法，分离土壤放线菌，并以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌作为指示菌来筛选具有抑菌活性的放线菌。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品

采自高黎贡山国家级自然保护区百花岭。

1.1.2 培养基

高氏1号培养基的配制参考李丽等(2018)[9]的研究方法；

牛肉膏蛋白胨培养基的配制参考戴航宇等(2020)[10]的研究方法。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤放线菌的筛选

将采集到的土壤湿土或风干样品称取5 g，加入到45 mL无菌水的三角瓶中，充分震荡并进行沉淀，吸取上清液用无菌水稀释成10−2～10−3的菌悬液，取0.1 mL在高氏1号培养基平板表面涂布均匀，28℃培养1 w。

用接种针挑取培养好的放线菌单菌落于高氏一号培养基上，用平板划线法[11]进一步分离纯化，培养6 d～7 d后形成单菌落，挑取单菌落于斜面培养基上划线培养，28℃培养1 w左右，于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 抑菌放线菌的筛选

用接种针分别将分离纯化好的放线菌依次接种到装有100 mL高氏1号液体培养基的三角瓶中（已灭菌），置于28℃、转速为195 rpm的培养箱中培养6 d，培养液用0.22 μm滤膜过滤，滤液4℃保存备用。

将指示菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，由保山学院微生物试验室提供）置于37℃、200 rpm，恒温培养12～24 h。再用移液枪各吸取0.1 mL菌液，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，待20 min～30 min菌液渗入培养基后，用灭菌的镊子夹取4张直径为5 mm的滤纸片，等距离的放在平板上，用无菌移液枪吸取200 μL的放线菌发酵滤液分别滴在3张滤纸片上，其中一张滤纸片滴加等量的无菌水做对照，做好标记后重复三次，在37℃的培养箱中培养12 h～24 h后观察和测量抑菌圈直径，筛选出具有抑菌活性的菌株。

1.2.3 放线菌的初步分类鉴定

1.2.3.1 菌株的培养特征

在高氏一号培养基上接种放线菌，28℃培养1 w，观察菌落的形态和生长情况[12]。

1.2.3.2 菌株的显微特征

将灭菌的盖玻片以45度角斜插入高氏一号培养基上，再在盖玻片一侧接种放线菌，28℃培养1周，菌丝生长并附着于盖玻片上，轻轻拔出盖玻片，在显微镜下观察菌丝和孢子的形态[13]。

1.2.3.3 菌株的生理生化特征

明胶液化试验：在明胶液化培养基斜面上接种菌种，28℃培养，于接种后第5d、第10d、第15 d将斜面培养基放到4℃，30 min后观察明胶液化程度，明胶水解阳性为菌落周围明胶转变为液体状态[14]。

淀粉水解试验：在淀粉水解培养基（可溶性淀粉5.0 g，NaCl 0.25 g，MgCO30.5 g，KNO30.5 g，KH2PO40.2 g，琼脂粉10.0 g，蒸馏水500 mL，pH 7.2～7.4）平板上接种菌株，28 ℃培养1周，滴加几滴碘酒于菌落附近，若淀粉不变蓝而是形成了透明圈，则有淀粉酶产生，圈越大说明淀粉酶活性越强[15]。

纤维素水解试验：把剪好的滤纸条的一端浸没在纤维素分解培养基试管中，灭菌，在液面以上的滤纸条上接种放线菌，28℃培养1 w，如果菌株产生纤维素酶则能水解滤纸条或者使其折断或变薄[16]。

牛奶的凝固与胨化试验：在脱脂牛奶管（牛奶500 mL，CaCO30.1 g）中接种菌株，28℃培养1～2周，凝固为牛奶出现凝块，胨化为凝固后有液体出现且凝块进一步水解成液体[17]。

产生硫化氢的试验：在硫化氢产生培养基中接种放线菌，28℃培养1 w，若有硫化氢产生则培养基会产生黑色素[18]。

1.2.4 发酵条件对发酵液抑菌活性的影响

将筛选到的抑菌放线菌采用以下不同发酵条件进行发酵，过滤后取发酵液原液，采用生长速率法测定其对指示菌的抑菌率，筛选抑菌活性最优的发酵条件。重复三次，取平均值。以未加放线菌菌株的发酵液作为对照。

1.2.4.1 不同发酵培养基的影响

采用4种培养基[12]，各取50 mL装入250 mL的三角瓶中28℃，280 r/min摇床培养6 d～7 d后取样，测抑菌率。

1.2.4.2 发酵时间的影响

在250 mL三角瓶中加入50 mL液体发酵培养基，195 rpm，28℃恒温培养，接种后第3 d、第4 d、第5 d、第6 d、第7 d、第8 d后取样，测抑菌率。

1.2.4.3 不同温度的影响

在250 mL三角瓶中加入50 mL液体发酵培养基（pH=7.0），分别于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃振荡培养1 w[19]，测抑菌率。

1.2.4.4 不同pH的影响

将液体发酵培养基的pH分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，各取50 mL培养基转移到250 mL三角瓶中，195 rpm，28℃振荡培养1 w，测抑菌率。

1.2.4.5 不同装液量的影响

分别在250 mL的三角瓶中加入40mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL发酵培养基，于195 rpm，28℃振荡培养1 w，测抑菌率。

1.2.5 发酵产物稳定性的研究

将筛选到的抑菌放线菌进行发酵培养，过滤后取发酵液原液分别置于不同温度，不同pH值和紫外条件下处理后，采用生长速率法，测定其对指示菌的抑菌率。重复三次，求平均值。以未加放线菌菌株的发酵液做对照。

1.2.5.1 热稳定性

在1.5 mL离心管中加入1 mL放线菌发酵液，分别于20℃、40℃、60℃、80℃水浴处理30 min，测抑制率。

1.2.5.2 pH耐受性

将放线菌发酵液的pH分别调到3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，然后在4℃的冰箱中静置24 h后将pH调回到7.0，取样测抑菌率。

1.2.5.3 发酵产物的紫外线耐受性

将菌株发酵液放置于无菌空平板中，开盖放置在紫外线[20]下，分别在10，20，30，40，50 min时取样测抑菌率。

2 结果与分析

2.1 放线菌的分离及抑菌活性的测定

从采集到的土壤中分离得到放线菌57株。采用滤纸片法对57株放线菌发酵液进行抑细菌活性的测定，测定结果显示有13株放线菌对细菌具有抑菌作用，其中菌株F27对三种指示菌均具有抑菌作用，且抑菌效果最好，抑菌直径都在16 mm以上，如图1所示。

图1 菌株F27抑菌放线菌对不同指示菌产生的抑菌圈

2.2 菌株的初步分类和鉴定

2.2.1 菌株F27的菌落培养特征

由图2可知，菌株F27的背面呈现浅黄色，正面呈现灰白色，油亮状，近圆形，形状较规则，菌落较厚，表面湿润，菌株边缘一圈为白色。表面有小孔，凹凸不平。

图2 菌株F27在高氏一号培养基上的培养特征

2.2.2 菌株F27的显微特征

图3所示菌株F27在显微镜下菌丝呈丝状分支，直径较细。孢子丝盘卷形成包囊，生长在气生菌丝的顶端。

图3 显微镜下菌株F27的菌丝形态

2.2.3 菌株F27的生理生化特征

对菌株F27进行生理生化特征试验，其结果见表1。

表1 菌株F27的生理生化特征

由表1可知，菌株F27能使明胶液化，可使淀粉水解，纤维素水解阴性，可使牛奶凝固和胨化，产黑色素。

由以上菌落形态特征、显微特征、生理生化特征分析，根据放线菌分类系统，可初步确定菌株F27为孢囊链霉菌属（Streptospo⁃rangium）。孢囊链霉菌属的放线菌具有由气生菌丝的孢子丝形成的孢囊，它长在气生菌丝主丝或侧丝的顶部，孢囊内部产生多个包囊孢子。由此初步确定菌株F27为孢囊链霉菌属。

2.3 发酵条件研究

指示菌选用枯草芽孢杆菌。

2.3.1 发酵培养基对发酵液抑菌活性的影响

采用4种不同配方的培养基对菌株F27进行培养，用生长速率法测定发酵液的抑制率，其结果见表2，菌株F27的4种发酵培养基对枯草芽孢杆菌都有抑制作用，其中最强的是发酵培养基1，其抑制率达到50%。

表2 不同发酵培养基对发酵液抑菌活性的影响

2.3.2 发酵培养时间对发酵液抑菌活性的影响

测定发酵液在第3、4、5、6、7、8 d对枯草芽孢杆菌的抑制率。其结果见表3，从第3 d到第6 d，菌株F27发酵液的抑菌活性在逐渐增强；从第7 d开始，发酵液的抑菌活性开始下降。确定第6 d为最佳发酵时间。

表3 不同培养时间对发酵液抑菌活性的影响

2.3.3 不同温度对发酵液抑菌活性的影响

不同温度的发酵处理测定其对枯草芽孢杆菌的抑制率，其结果见表4，菌株F27在28℃时抑制率达到86.67%，菌株发酵液的活性最强。

表4 温度对发酵液抑菌作用的影响

2.3.4 不同pH对发酵液抑菌活性的影响

不同pH的发酵处理测定其对枯草芽孢杆菌的抑制率，其结果见表5，在pH为7.0时，发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制率最高，随着pH的升高或降低，发酵液的活性都有所下降。当pH小于5.0或大于10.0时，菌株F27发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制率几乎为0。所以pH为7.0为最佳发酵pH。

表5 pH对发酵液抑菌作用的影响

2.3.5 不同装液量的影响

装液量会影响菌株发酵过程中的含氧量，进而影响菌株的生长和代谢产物的生成。所以不同装液量的氧气含量是非常重要的。由表6可知，当装液量小于50 mL时，随着装液量的增加菌株发酵液的抑菌活性也增强，当装液量达到50 mL时发酵液的活性达到最大，之后随装液量增加发酵液的抑菌活性反而降低。故最佳装液量为50 mL。

表6 装液量对发酵液抑菌作用的影响

2.4 发酵液稳定性研究

选用枯草芽孢杆菌作为指示菌。

2.4.1 发酵液的热稳定性研究

发酵液经过不同温度处理后的热稳定性的结果见表7，发酵液的抑菌活性随着温度的升高而明显降低。因此，菌株F27的发酵液（代谢产物）不耐热，对高温耐受性很差。

表7 发酵液的热稳定性研究

2.4.2 发酵液的pH耐受性研究

发酵液经过不同的pH处理后其抑制率见表8，菌株发酵液在pH为7.0时的活性最高，在酸性和碱性条件下，抑菌活性都有所下降，在pH为3.0时抑制率为0。可以得出菌株F27的发酵产物对酸碱的耐受性很差。

表8 发酵液的pH耐受性研究

2.4.3 发酵液紫外线照射研究

发酵液经不同时间的紫外线处理后对枯草芽孢杆菌的抑菌活性结果见表9，随着照射的时间增长，发酵液的抑菌活性也有所下降，经照射50 min后抑菌效果几乎为0。可以得出菌株F27的代谢产物受紫外线照射的影响很大，且对紫外线的耐受性很差。

表9 发酵液紫外线照射研究

3 讨论与结论

放线菌是一类微生物资源菌[21]，能够代谢产生多种活性物质。从微生物中获得的22 500种[22]生物活性化合物中，有45%[22]是来自放线菌，并能抑制其他微生物的生长。张孟等[23]从海洋中分离到具有抑菌作用的小单孢菌属，并对其抑菌活性物质进行了热稳定性、pH耐受性、紫外照射和各种酶处理等研究；张志斌等[24]从植物根际分离到具有抑制真菌的植物内生放线菌，并从菌株发酵液中分离出抑菌活性化合物。放线菌还可以通过对土壤和植物根系间的碳源竞争，可以有效抑制病原菌的生长，最后达到防止植物受到病原菌污染的目的[25]。

本研究从高黎贡山百花岭国家自然保护区土壤中共分离到放线菌57株。对分离得到的57株放线菌发酵液采用滤纸片法进行抑菌活性的测定，筛选出13株放线菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌具有抑菌作用。其中菌株F27对3种指示菌都具有抑菌作用，并且抑菌效果最好，经测定抑菌直径都在16 mm以上。通过对菌株F27的显微特征、培养特征和生理生化特征观察，初步确定菌株F27为孢囊链霉菌属。对菌株F27的发酵条件进行研究，其最佳发酵时间为6 d，发酵培养基初始pH值7.0，培养温度为28℃，最佳发酵培养基为培养基1，装液量50 mL/250 mL。通过对发酵产物稳定性研究，初步判断菌株F27的热稳定性、紫外线照射性和pH耐受性都比较差。微生物在发酵过程中是活性物质不断积累的过程，菌株F27怎样充分利用发酵条件，提高发酵效率，从而获得高质量抗生素，具有进一步研究的意义。