白藜芦醇通过调节海马中小胶质细胞的极化状态改善APP/PS1小鼠的认知功能*

陈晓燕，王 礼，李 啸

(1.陆军军医大学第二附属医院神经内科，重庆 400037； 2.重庆市高新区人民医院内科 400039)

阿尔茨海默病(AD)是最常见的一种中枢神经系统退行性疾病，是造成痴呆的最主要原因。其起病隐匿，早期症状不明显，然而随着病程进展，恶化迅速，易衍变成不可逆的损害。β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积、神经纤维缠结和神经元丢失是AD的主要病理表现，其中Aβ沉积导致的过度炎症水平是AD的主要发病机制之一[1]。而中枢固有免疫细胞小胶质细胞则可以通过调节脑内的炎症水平参与AD的发生与发展，其中当小胶质细胞向M1型极化时，会引起过度的炎性反应，而当其向M2型极化时，则可以有效地抑制炎性反应[2]。最新研究表明，调节小胶质细胞向M2型极化可有效改善AD小鼠模型的认知功能障碍[3]。白藜芦醇(RSV)作为一种天然的多酚类物质，其主要来源于花生、葡萄等植物中，有研究表明其具有抗炎、抗氧化应激及抗衰老等作用[4]。而RSV能否通过调节小胶质细胞的极化来改善AD小鼠的认知功能障碍目前尚少有报道。本研究采用APP/PS1转基因的经典AD模型小鼠，给予RSV处理，观察其对APP/PS1小鼠认知功能的改善作用及小鼠海马中小胶质细胞极化水平的影响，并探讨其中相关的分子机制，为AD 的防治提供新思路和新策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要材料与试剂

RSV(美国Sigma公司)，沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)抗体(英国Abcam公司)，离子钙接头蛋白1(Iba-1)抗体(英国Abcam公司)，GAPDH抗体(美国Boster公司)，荧光二抗( 美国Life Technologies公司)，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa 公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，白细胞介素(IL)-6，IL-1β、IL-10、Arginase1、GAPDH引物(上海生工公司)等。合成引物序列见表1。

表1 合成引物序列

1.1.2实验动物

9月龄的雄性 APP/PS1小鼠及同窝野生型(WT)雄性小鼠购买自南京模式动物中心，所有的小鼠都饲养在适宜湿度(50%左右)及适宜温度(21 ℃左右)的洁净环境中分笼饲养，水与食物供给充足，自由进食。有关动物的相关实验流程与规范都按照陆军军医大学实验动物管理及保护的有关规定进行。

1.2 方法

1.2.1实验分组与药物处理

共纳入45只雄性小鼠，其中15只WT小鼠为对照组(WT组)，另外30只APP/PS1小鼠采用随机数字表的方法将其分为AD模型组(AD组)与AD RSV治疗组(AD+RSV组)，每组15只。参照文献[4]报道的方法，给予AD+RSV组小鼠腹腔注射RSV(40 mg/kg)，总共注射28 d。WT组与AD组小鼠给予等剂量的生理盐水。

1.2.2Morris水迷宫行为学实验

在给药结束后，采用Morris水迷宫行为学系统对小鼠的空间学习和记忆能力进行检测。参照文献[5]方法进行，小鼠在正式检测前接受1 d的适应性训练，以消除不同实验组中对实验平台每个象限之间的偏好，再对小鼠进行4 d正式的实验训练，让它们找到一个隐藏的平台，习惯于游泳和找到对应的平台，每天进行4次训练，每次训练60 s，让小鼠每次在平台上停留20 s。在第5天的时候，为了评估小鼠对有平台象限的记忆水平，进行正式检测，并移除平台。记录每只小鼠搜索到正确象限的时间，并测量进入正确象限的次数。

1.2.3免疫组织化学(IHC)与免疫荧光检测

小鼠行为学检测后，取材，利用4%多聚甲醛固定24 h，接着用30%蔗糖+4%多聚甲醛脱水48 h后，用冰冻切片机进行组织切片。用0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗小鼠脑组织切片，加入相对应的一抗(兔抗SIRT1、鼠抗Iba-1)，并放入到4 ℃冰箱中孵育12 h，用PBS漂洗，加入对应的荧光二抗(488抗鼠、Cy3抗兔)，接着放入37 ℃中继续孵育2 h，用PBS漂洗，IHC采用SABC继续孵育1 h后，用二氨基联苯胺(DAB)显色。免疫荧光的则直接利用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核，继续用PBS漂洗，贴片，干燥，封片。采用荧光显微镜拍照，并统计海马中Iba-1阳性细胞及Iba-1与SIRT1双阳性细胞的密度。每组共采用4个样本进行检测。

1.2.4Western blot检测

将海马组织在冰上分离出来，按照100 μL/mg加入组织裂解液，利用组织破碎机进行充分研磨，离心后取上清液。并采用二喹啉甲酸(BCA)法测出蛋白浓度。配置十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，在每个凝胶孔中加入各组对应的蛋白样品，放入电泳槽中进行 SDS-PAGE，接着进行转膜，再将膜放入到5%的脱脂奶粉溶液中常温下封闭3 h，分别加入SIRT1和GAPDH的抗体，放在4 ℃条件下孵育12 h，并用TBST清洗，加入对应的二抗，在37 ℃孵箱中孵育2 h，并用TBST清洗，加入发光液曝光，将聚偏氟乙烯(PVDF)膜上的水吸干，用Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像系统显影采图。用 ImageJ软件进行灰度值分析，以 GAPDH为内参算出SIRT1蛋白的相对表达水平，并以WT组为对照，分别计算出AD组和AD+RSV组的相对表达量，每组采用4个样本进行检测。

1.2.5实时定量PCR

在冰上分离海马组织，并放入到1.5 mL无酶管中，每管分别加入1 mL的Trizol，利用组织破碎机充分研磨，接着每管中加入200 μL的氯仿，盖好盖子进行剧烈震荡15 s再放置3 min，离心，吸取上层无色水相层，转移到另外一个无酶管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，在室温条件下静置10 min，离心，去掉上清液，用75%乙醇洗涤沉淀，室温放置晾干，每管中加入20 μL的无酶水溶解RNA，采用紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度。接着按照说明书上的方法去除DNA杂质，并将RNA逆转录成cDNA，最后分别加入对应的引物进行实时定量PCR。每组共检测4个样本。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠认知功能相关指标比较

利用Morris水迷宫行为学检测发现，在训练的第3、4天，AD组的小鼠找到平台所需要的时间较WT组明显增加(P<0.05)，而在训练的第3、4天，AD+RSV组小鼠找到平台所需的时间较AD组明显降低(P<0.05)。在第5天撤去平台后，AD组小鼠比WT组小鼠在目标象限停留的时间明显降低(P<0.05)，且进入目标象限的次数也明显减低(P<0.05)；与AD组小鼠比较，AD+RSV组小鼠在目标象限停留的时间及进入目标象限的次数均明显增加(P<0.05)，见图1。

a：P<0.05，与WT组比较；b：P<0.05，与AD+RSV组比较。

2.2 各组小鼠海马中炎症因子相对表达水平比较

利用实时定量PCR对小鼠海马中的炎症因子检测发现，与WT组小鼠比较，AD组小鼠海马中的M1型小胶质细胞相关的促炎因子IL-6与IL-1β表达水平明显增加(P<0.05)。与AD组小鼠比较，AD+RSV组小鼠海马中M1型小胶质细胞相关的炎症因子IL-6与IL-1β的表达水平明显降低(P<0.05)，同时AD+RSV组小鼠海马中M2型小胶质细胞相关抗炎因子IL-10与Arginase1的表达水平明显增加(P<0.05)，见图2。

2.3 各组小鼠海马中小胶质细胞上SIRT1相对表达水平比较

利用免疫荧光染色发现，AD组小鼠海马中的小胶质细胞数量较WT组小鼠明显增加(P<0.05)，而相对于AD组，AD+RSV组小鼠海马中的小胶质细胞数量无明显的变化(P>0.05)，见图3。同时，利用免疫荧光双标发现，AD组小鼠海马中SIRT1与Iba-1双标的数量较WT组明显降低(P<0.05)，而AD+RSV组小鼠海马中SIRT1与Iba-1双标的数量较AD组明显增加(P<0.05)。采用Western blot检测发现，相对于AD组，D+RSV组小鼠海马中SIRT1的相对表达水平明显增加(P<0.05)，见图4。

a：P<0.05，与WT组比较；b：P<0.05，与AD+RSV组比较。

A、B、C：WT组、AD组、AD+RSV组小鼠海马中Iba-1表达(IHC，×50)；D：各组小鼠海马中Iba-1阳性细胞比较；a：P<0.05，与WT组比较。

A、B、C：WT组、AD组、AD+RSV组小鼠海马中Iba-1和SIRT1免疫荧光双标染色(×200，箭头代表Iba-1和SIRT1双阳性细胞)；D：各组小鼠海马中Iba-1与SIRT1双阳性细胞百分比比较；E：Western blot；F：SIRT1蛋白半定量分析；a：P<0.05，与AD组比较。

3 讨 论

本研究发现，对于APP/PS1转基因AD小鼠模型，给予RSV处理后，可以上调AD小鼠海马中小胶质细胞上SIRT1的表达，促使小胶质细胞向M2型极化，减轻脑内的炎性反应，进而有效地改善AD小鼠的认知功能障碍。本研究提示，RSV可作为治疗AD的潜在药物，通过调节小胶质细胞上SIRT1的表达使其向M2型极化可能是治疗AD的一个新靶点。

众所周知，炎性反应在AD的发生发展中扮演着极其关键的作用[6]。在AD的动物模型中发现，Aβ和tau蛋白的聚集可以引起脑内过度的炎性反应，释放大量的促炎因子，包括IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等，进而触发大脑的神经过度退化进程[7]。另外，一项基于网络的AD相关基因整合分析显示，免疫/小胶质细胞基因网络与AD神经病理学的联系最为紧密[8]。同时，在临床AD患者中研究发现，其脑内的炎症水平明显高于健康者[9-10]。而小胶质细胞作为中枢系统中极其关键的一种免疫细胞，可以及时应对大脑中的有害刺激,其中就包括Aβ等错误折叠的蛋白质。但如果这种刺激未得到及时解决，小胶质细胞的慢性激活将减弱其正常生理功能，变为过度活化状态，即M1型小胶质细胞，会过度表达促炎的标志物，比如IL-1β、TNF-α、CD36、CD14、CD11c和MHC-Ⅱ等，进而对神经元造成损伤[11-12]。然而，当小胶质细胞处于抗炎保护状态，即M2型时，可以释放抗炎因子(IL-10，TGF-β)、细胞生长因子(IGF-1，FGF，CSF1)、神经营养因子(NGF，BDNF，GDNF)，进而起到抗炎与神经保护作用[13]。因此，小胶质细胞的极化状态，在AD的发生、发展中扮演至关重要的作用。而有研究表明，SIRT1对小胶质细胞的极化状态能够起到调节作用，当上调SIRT1水平可以有效地使小胶质细胞向M2型极化，从而起到抗炎及神经保护的作用[14-15]，这也在本研究中得到了证实，本研究发现RSV处理后可以上调SIRT1的表达水平，进而使小胶质细胞向M2型转化。有研究发现，采用干预手段，如壳多糖酶处理，可以通过使小胶质细胞向M2型转化进而改善AD大鼠的认知功能障碍[16]。以上研究也进一步证实了小胶质细胞的极化状态在AD的发生、发展及治疗中发挥着关键作用，而调节SIRT1的表达可调节小胶质细胞的极化水平，进而为AD的治疗提供新靶点。

RSV作为一种多酚类化合物，其可以通过激活SIRT1基因来影响机体的代谢及表观遗传，进而起到抗炎、抗氧化、抗衰老等功能[17]。一项临床试验研究发现，给予正常的老年患者连续服用26周的RSV，可以明显地增加其海马中的神经发生与神经功能连接，进而改善老年患者的记忆认知功能[18]。而SIRT1作为RSV的一个靶向调控基因，在AD的病理生理机制中也扮演关键作用。有研究表明，上调SIRT1的水平，可以有效地降低AD模型小鼠脑中的Aβ蛋白水平，进而改善其认知功能[19]。在本研究中，通过RSV处理上调小胶质细胞上的SIRT1水平，可以促进小胶质细胞向M2型转化，进而改善AD模型小鼠的认知功能，进一步阐述了RSV改善AD模型小鼠认知功能障碍的相关机制。

综上所述，本研究从小胶质细胞极化的角度探讨了RSV对AD模型小鼠的治疗作用。从实验结果中发现，RSV处理可以有效地上调AD模型小鼠海马中小胶质细胞上SIRT1的表达水平，进而促进小胶质细胞向M2型极化，减轻AD小鼠脑内的过度炎性反应，进而改善AD模型小鼠的认知功能障碍。该研究可为下一步治疗AD患者提供新的方向与靶点，并为RSV应用于临床治疗AD患者提供理论依据。