泥鳅白头病病原菌的分离鉴定、药敏试验及拮抗菌的筛选

刘有华，许 赛，王倩楠，皮乔木，徐思琪，安贤惠，李联泰

(江苏海洋大学，江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室，江苏连云港 222005)

泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)属鲤形目鳅科泥鳅属，其营养丰富、味道鲜美，被誉为“水中人参”，是国内外消费者最喜爱的美味佳肴之一[1]。因其生长快、产量高、收益好等特点，近年来泥鳅养殖得到迅猛发展[2]。其中，江苏省连云港市是全国泥鳅养殖和出口的重要地区，每年出口泥鳅约1×104吨，产值逾4×107美元[3]。随着泥鳅高密度养殖的发展，病害问题也日渐突出，给养殖户造成较大的经济损失[4-5]。引起泥鳅病害的原因主要包括细菌性疾病、寄生虫病和环境因素等，其中温和气单胞菌(Aeromonassobria)[6]、创伤弧菌(Vibriovulnificus)[7]和凡隆气单胞菌(A.veronii)[8-9]等细菌性疾病占有相当大的比例。温和气单胞菌主要引起泥鳅皮肤点状出血、皮肤和肌肉严重溃烂[4]，腹部和肛门红肿等[10]；创伤弧菌感染使泥鳅体表变色、充血，且感染部位逐渐溃烂[7]；凡隆气单胞菌同样会引起泥鳅体表充血发红，游泳活力减退等症状[8]。

2020年7月，江苏省连云港市赣榆区墩尚镇许多池塘养殖的泥鳅，先后发生“白头病”，症状表现为吻部至眼前的一段皮肤呈乳白色，鳃部腐烂，部分断须，每日死亡率达5%，给当地养殖户造成重大经济损失。几种常见水产药物对此病无作用，且目前有关泥鳅白头病病害问题还未见报道。为摸清该病害的致病原因，本研究通过病原菌分离、人工感染实验、生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析等方法分离鉴定泥鳅白头病病原菌并分析其致病性，然后测定病原菌药物敏感性，最后进行拮抗菌的筛选，为预防和治疗该病提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病鱼来源

发病泥鳅于2020年7月25日采自江苏省连云港市赣榆区墩尚镇武山桥村的一家泥鳅养殖场。健康泥鳅由江苏省连云港彬翔水产有限公司提供，泥鳅平均体长为(11±0.5) cm。

1.1.2 菌株

CMA-1[9]：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、4-1-3[11]：荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、E14[12]：短小芽孢杆菌(B.pumilus)、X8[3]：解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)均为江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室保存的菌株。

1.1.3 主要试剂

革兰氏染色液购自安徽省巢湖市弘慈医疗器械有限公司；细菌微量鉴定管购自杭州百思生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州滨和生物试剂有限公司；引物合成及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.4 培养基

LB培养基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂20 g/L(液体培养基中不加)，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离、筛选

在无菌条件下，从患病泥鳅病灶部位(头部、体表、肝脏)分别取样，用无菌剪刀剪碎并置于LB液体培养基中，28 ℃培养2 h，然后稀释涂布于LB固体培养基中，28 ℃培养24 h，挑选单个优势菌落再次划线培养，两次纯化后挑取单个菌落转接至斜面培养基保存备用[13]。将分离得到的各菌株接种于LB液体培养基中，28 ℃培养24 h，然后分别回归感染健康泥鳅，观察发病情况，筛选可染病的病原菌株。为确认病原菌株，从实验中被感染的泥鳅病灶处，采用同样方法再次分离病原菌并回归感染健康泥鳅，观察感染症状是否一致[3]。

1.2.2 人工感染

取分离得到的病原菌接种于LB液体培养基，180 r/min，28 ℃恒温培养24 h，用无菌生理盐水依次稀释至浓度为1.6×107CFU/mL(5倍稀释)、8.0×106CFU/mL(10倍稀释)和4.0×106CFU/mL(20倍稀释)3个梯度的菌液，采用腹腔注射、创伤和浸泡三种方法进行人工感染[8]，每种感染包括3个梯度，每个梯度重复3次，每个重复感染10尾泥鳅。其中，腹腔注射是每尾注射0.1 mL菌液，以每尾注射0.1 mL无菌生理盐水为对照；创伤是将泥鳅表皮划破，置菌液中浸泡感染，以不添加菌液浸泡为对照；浸泡是选择体表无损伤的健康泥鳅，置菌液中浸泡感染，以养殖水体中不添加菌液为对照。除以上条件外，其它条件基本相同：选择的健康泥鳅大小相似，体长(11±0.5) cm，养殖水温(26.5±1.0) ℃，pH(7.8±0.2)，NH3-N(1.5±0.1) μg/L，NO2-N(50±6) μg/L。

1.2.3 病原菌的鉴定

菌株的形态观察和生理生化鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》[14]进行。

提取细菌基因组DNA，利用通用引物27F和1492R对菌株W1进行16S rRNA基因PCR扩增。上游引物为27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物为1492R：5′-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系为(25 μL)：2×San Taq PCR Mix 12.5 μL，27F 1.0 μL(25 μmol/L)，1492R 1.0 μL(50 μmol/L)，DNA模板1.0 μL(10 mmol/L)，dd H2O 9.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环35次；72 ℃终延伸7 min，在4 ℃下保存。将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序得到的16S rRNA基因序列在NCBI中进行BLAST序列比对，查找相似性较高的模式菌株的16S rRNA基因序列，应用MEGA7.0软件进行聚类分析和构建系统发育进化树。

1.2.4 药敏试验

药敏试验采用K-B纸片扩散法[15]，28 ℃培养24 h后测定抑菌圈直径(mm)。

1.2.5 病原菌的特性研究

用HCl和NaOH调节培养基pH为4、5、6、7、8、9。将病原菌W1以0.5%的接种量接种于装液量为30%(即250 mL三角瓶中装75 mL培养基，下同)的各培养基中。28 ℃下，180 r/min培养24 h。采用光电比浊法[16]，取3 mL菌液在波长为600 nm处测定吸光度值OD600 nm，用来表示细菌生物量，重复3次。

用NaCl调节培养基盐度为0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%。将病原菌以0.5%的接种量接种于装液量为30%的各培养基中。28 ℃下，180 r/min培养24 h。整个过程，重复操作3次。

1.2.6 拮抗菌的筛选

采用滤纸片抑菌圈法[17]研究本实验室保存的4株菌(CMA-1、4-1-3、E14和X8)对病原菌W1的拮抗效果。将病原菌W1在28 ℃，180 r/min下培养24 h，取20 μL培养液均匀涂布于LB固体培养基中，将直径为6 mm的无菌滤纸片置于培养皿中，再将20 μL待测菌液滴加于滤纸片上，28 ℃培养24 h后观察并测定抑菌圈直径。

2 结果

2.1 人工感染实验

从病灶部位共分离得到W1、Q1、X1等7株优势菌，经人工感染实验发现只有W1对泥鳅具有高致病率，其余几株对泥鳅不具致病性。人工感染情况如表1所示。创伤和浸泡感染死亡率为100%，其中在1.6×107CFU/mL浓度感染下10尾泥鳅均在第1天全部死亡。腹腔注射感染法在1.6×107CFU/mL浓度感染下的死亡率为80%。经人工感染的泥鳅症状与自然发病的泥鳅症状一致，从吻部到眼前的一段皮肤呈乳白色，鳃部腐烂，断须。

表1 人工感染实验结果Tab.1 Results of artificial infection experiment

2.2 病原菌W1的鉴定

2.2.1 形态特征和生理生化鉴定

经观察，菌株W1菌落呈圆形，淡黄色，表面光滑，边缘整齐，中央隆起，不透明。显微镜观察菌体呈杆状，大小为(2.13±0.11) μm×(0.87±0.06) μm，革兰氏阴性。菌株W1的生理生化特性见表2。

2.2.2 16S rRNA基因系统发育地位

以菌株W1基因组DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得到其16S rRNA基因序列，大小为1425 bp。把序列提交至GenBank数据库中，获得登录号为MW 265010。将获得的16S rRNA基因序列在NCBI中进行BLAST序列比对，采用MEGA7.0软件将该菌株与数据库相似性较高的模式菌株进行了系统发育进化分析并绘制系统发育树(图1)，结果表明，菌株W1与维氏气单胞菌(Aeromonasveronii) ATCC33624的亲缘关系最近，相似性达98.8%以上。结合形态特征观察、生理生化反应，将菌株W1初步确定为维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)。

表2 菌株W1的生理生化反应结果Tab.2 Results of physiological and biochemical reactions of strain W1

图1 基于16S rRNA基因序列构建的菌株W1系统发育树Fig.1 Phylogenetics tree based on 16S rRNA gene sequence of strain W1 括号内为菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登录号；分支结点处数字为Bootstrap值；标尺的数据为进化距离.

2.3 药敏试验结果

病原菌W1对15种抗生素的药敏试验结果见表3。该菌对头孢克肟高度敏感，对呋喃唑酮、链霉素、庆大霉素和恩诺沙星中度敏感，对红霉素、环丙沙星、四环素等表现一定程度的耐药性。

表3 菌株W1的药敏试验结果Tab.3 The drug sensitivity test of strain W1

2.4 病原菌W1的特性研究

2.4.1 W1对不同pH的适应性

菌株W1在pH 5～9之间均能生长，且在此范围内pH对菌株W1的生长影响不大(图2)。在pH为4时几乎不能生长，说明过酸会抑制其生长。

2.4.2 W1对不同盐度的适应性

如图3所示，菌株W1在盐度0%～2.00%内均能不同程度地生长，且生长无明显规律，说明菌株W1对此盐度范围具有较好的适应性。

图2 不同pH对菌株W1生长的影响Fig.2 Effect of different pH on the growth of strain W1 小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，图3同

图3 不同盐度对菌株W1生长的影响Fig.3 Effect of different salinity on the growth of strain W1

2.5 拮抗菌的筛选

按方法1.2.6进行操作，结果如图4所示。菌株X8和菌株E14出现抑菌圈，其抑菌圈直径分别为(12.2±0.2) mm和(10.3±0.3) mm。表明这两株菌对病原菌W1具有拮抗作用，特别是菌株X8拮抗效果突出。

图4 拮抗菌的筛选Fig.4 Screening of antagonistic bacteria

3 讨论

泥鳅在养殖过程中可能发生的疾病种类很多，如赤鳍病、烂鳃病、肠炎病、出血病等等，其中，赤鳍病主要症状表现为鳅体表及鳍部表皮剥落呈灰白色，腹部和体侧出现红斑，并逐渐变成深红色[18]。烂鳃病因其鳃组织腐烂所致，泥鳅体色发黑，鳃丝腐烂发白[19]。患肠炎病的泥鳅体表出现红斑，肠壁充血发炎，腹部膨大，肛门红肿，肠道呈紫红色[4,20]。泥鳅出血病的症状为体表出现点状、块状充血或出血，内脏也有出血，呈败血症症状[21]。不同疾病诱因不同，引发这些疾病的病原主要有温和气单胞菌、创伤弧菌、霍乱弧菌及维氏气单胞菌等[6-9,22-23]。本研究从患白头病泥鳅中分离、筛选到一株致病菌，经鉴定为维氏气单胞菌，经回归感染的病泥鳅表现症状主要为吻部前端发白、鳃部腐烂、断须、活力较弱，这与曾明华等[24]研究的由温和气单胞菌引起的黄鳝白头病症状相似。除曾明华等[24]发现的黄鳝白头病外，有关白头病在其它水产物种出现的病例还未见报道。

维氏气单胞菌又称凡隆气单胞菌、维罗纳气单胞菌，隶属弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，是一种革兰氏阴性菌[25]。广泛分布于淡水、污水及土壤中，不仅能引起多种水产动物疾病，还会感染人类导致腹泻，引起菌血症、脑膜炎和心内膜炎等[26]。关于维氏气单胞菌引发水产动物疾病的报道频发，如：中华鳖腐皮、口咽腔溃烂综合症疾病[27]，泥鳅腐皮病[6,8]，斑点叉尾鮰的急性死亡[28]和锦鲤鱼肠炎[29]等。在以往的研究中发现维氏气单胞菌能引起泥鳅腐皮病，并且一旦发生感染，泥鳅摄食及游泳活力很快减退，然后开始死亡，且死亡率高[8]。相较于以往研究结果，菌株W1的致病症状虽有所不同，但感染速度快和死亡率高这一特点与其相同。因此本研究筛选得到的维氏气单胞菌W1对水产动物的危害有待进一步研究。

近年来，随着水产药物，特别是抗生素的大量使用，由此造成的细菌的耐药性、水环境的生态失衡以及残留物对人体的危害引起人们的极大关注[30]。因此用益生菌替代化学药物受到广泛的重视[31]，益生菌的使用也成为水产疾病防控的重要途径[32]。本研究通过对泥鳅白头病病原菌的拮抗菌筛选，发现解淀粉芽孢杆菌X8对该病原菌W1具有较强的抑制作用。解淀粉芽孢杆菌作为重要的生防细菌，其抗菌谱较为广泛[33]。孙梅等[34]筛选得到的解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA对维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌具有不同程度的抑制作用。解淀粉芽孢杆菌X8同样具有广谱性，不仅对维氏气单胞菌具有较强的抑制作用，对其它水产病原菌如杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌等也具有较好的拮抗作用[3]，已有实验证明其应用的安全性[35]，因此X8菌株有望用于维氏气单胞菌引起的水产病害的防治。