上海市某原种鸡场禽白血病净化效果评估

于慧茹，陶田谷晟，杨显超，刘健，李鑫，白艺兰，王建，李凯航，周锦萍

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)

禽白血病(avian leukosis)是由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病[1]。该病为鸡群中普遍存在并诱发肿瘤的三大类病之一，对养禽业的危害几乎波及所有商品鸡群。禽白血病的防治尚无有效疫苗及药物，各国主要通过对鸡群开展病毒净化来控制该病。由于该病的垂直传播机制，从种禽到商品禽会产生逐级放大效应，因此对原种禽场的净化显得尤为重要。本研究采用禽白血病净化技术结合生物安全防控措施对上海市某原种鸡场开展了禽白血病的净化工作，经过4个世代的净化，原种鸡场的禽白血病病原阳性率显著降低，生产性能也得到提高，为原种鸡场的禽白血病净化提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

在对上海市某原种鸡场的某地方品种调查的基础上，于2017—2020年对其保种核心群进行连续4个世代外源性ALV的检测与净化。试验采集的样品包括胎粪、种蛋、血液、抗凝血和精液。

1.2 主要试剂

ALV p27抗原、ALV A/B亚群(ALV-A/B)抗体、ALV J亚群(ALV-J)抗体ELISA检测试剂盒，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司(货号分别为99-09257、99-09268、99-09254)；DMEM细胞培养液、胎牛血清(FBS)、胰酶消化液(0.25%)、青链霉素溶液(100×)，购自GIBCO公司；两性霉素B，购自北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。DF-1细胞由山东农业大学动物科技学院禽病研究室赠送。

1.3 样品的采集及处理

1.3.1 胎粪样品采集与处理

轻轻挤压1日龄雏鸡腹部，用采样棉签在肛门处沾取粪便置于装有0.5 mL稀释液的离心管中，将棉签头折断放于管中，标记，用振荡器进行10 s短暂振荡，液氮冻存。每只母鸡的雏鸡采集完胎粪后，更换手套或洗手消毒。检测前，取出冻存管，静置3 min后，取上清直接用于p27抗原检测。

1.3.2 蛋清样品采集与处理

每枚鸡蛋吸取1 mL左右蛋清置于1.5 mL离心管中，反复冻融3次。冻存时可使用液氮罐进行速冻，也可用-80 ℃冰箱进行冻存，蛋清样品直接检测p27抗原。

1.3.3 血浆样品采集与处理

母鸡全血按照蛋号进行全血采集，公鸡全血与精液对应采集。用肝素钠抗凝管静脉采集1 mL血液，颠倒混匀3次，2 000 r/min离心2 min，吸取血浆备用。

1.3.4 精液样品采集与处理

无菌采集公鸡精液50 μL以上，取40 μL加入到160 μL的精液稀释液(PBS中加入1%双抗、0.4%两性霉素B)中，振荡混匀，3 000 r/min离心2 min备用。

1.3.5 ALV分离培养

吸取100 μL处理好的血浆或精液样品接种到24孔细胞板DF-1细胞中，37 ℃作用2 h。吸附完成后倾去上清，在每个孔中加入0.5 mL PBS，将细胞清洗1遍，弃去洗液加入0.5 mL维持液(DMEM培养液中加入1% PBS、1%双抗、0.4%两性霉素B)。将24孔板维持生长9 d，收集细胞上清进行p27抗原检测。

1.3.6 检测方法

将处理好的血清按照IDEXX公司ALV-A/B、ALV-J 抗体检测试剂盒说明书进行。对处理好的胎粪、蛋清及血浆、精液的病毒分离细胞上清，按照IDEXX公司ALV- p27抗原检测试剂盒说明书，进行p27抗原检测。

1.4 原种鸡场摸底调查

随机采集鸡场种母鸡抗凝血200份，公鸡抗凝血、公鸡精液各50份，种蛋250份，进行 ALV- p27抗原检测；公鸡、母鸡全血各50份，进行ALV- A/B抗体、ALV-J抗体检测。

1.5 生物安全防控

对保种场的基础设施设备及生物安全、生产管理等进行评估和完善[2]。配合出雏期纸袋孵化、育雏期隔板阻挡等创新措施降低水平传播。在消毒管理、无害化处理、卫生环保等关键风险点进行完善，降低病毒内外部传播的风险。在生产防疫管理、种源管理、净化团队建设等生产管理要求进一步规范，提升人员防疫意识。

1.6 净化方案

参照文献[3]，在1日龄、育雏后期(12周龄)、初产期(26周龄)、留种前(35周龄)4个时间点开展监测。在1日龄进行胎粪p27检测，发现阳性个体采取同母淘汰；育雏后期采集血浆进行病毒分离，发现阳性个体进行同群淘汰；初产期分别采集血浆、公鸡精液进行病毒分离，采集初产蛋3枚普检，淘汰阳性个体；留种前，采集血浆和精液病毒分离后普检，淘汰阳性个体。其中该场在0世代全群监测，第1世代开始追踪检测，并根据检测结果，随时调整检测频率和采样数量。

1.7 生产性能评估

建立相应的基准线，采用同样的采样日龄、样品类型和检测方法，对保种群各世代18周龄体重进行测定，56周龄总产蛋数、繁殖性能(种蛋受精率、入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率)、成活率(育雏期成活率、育成期成活率、产蛋期成活率)进行统计。

1.8 数据统计与分析

用Excel、SPSS Statistics 26.0软件对A保种群各生产性能指标进行整理与分析，最小显著差数法(LSD)对净化种鸡18周龄体重多重比较，数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 ALV流行性调查

ALV流行性调查结果显示(表1)，该种鸡场母鸡血浆p27阳性率为5.0%，公鸡血浆p27抗原阳性率为4.0%，公鸡精液p27抗原阳性率为2.0%，蛋清p27抗原阳性率为6.0%。ALV-A/B抗体阳性率母鸡为36.0%，公鸡为4.0%。ALV-J抗体阳性率母鸡为8.0%，公鸡为6.0%，母鸡ALV-A/B、ALV-J抗体阳性率均高于公鸡。

表1 ALV流行性调查结果 %

2.2 禽白血病净化情况

保种群禽白血病净化检测结果显示(表2)，经过连续4个世代的净化，核心保种群初产期血浆病毒分离率从第0世代的9.10%降至第3世代的0.50%，公鸡精液病毒分离率从第0世代的3.26%降至第3世代的0，初产蛋p27抗原阳性率从第0世代的2.04%降至第2世代的0.60%。

表2 净化监测数据汇总

2.3 禽白血病对鸡生产性能影响

随着净化的实施，保种群产蛋性能明显提高，与净化起始阶段原鸡群(0世代)对比，3世代种鸡群56周龄产蛋数明显增加，平均净增8.95个(见图1)。

图1 禽白血病净化对鸡保种群56周龄产蛋数的影响

成活率测定对比中，经过逐代净化，育雏期成活率、育成期成活率、产蛋期成活率均有不同程度的增加，第3世代较第0世代分别增长3.01%、2.17%和1.48%(见图2)。

图2 禽白血病净化对鸡保种群成活率的影响

繁殖性能方面对比，种蛋受精率、受精蛋孵化率与0世代基本持平，入孵蛋孵化率相比第0世代提升2.72%(见图3)。

各世代种鸡18周龄平均体重无显著差异(P>0.05)，但整体呈逐代增加趋势。第3世代相对第0世代，公鸡平均体重增长35 g，母鸡增长19 g(见表3)。

图3 禽白血病净化对鸡保种群繁殖性能的影响

表3 18周龄体重测定比较 g

3 讨论

从流行病学调查来看，该原种鸡场禽白血病存在低水平感染，这既是疫病暴发的隐患也是净化实施的良好时机。杨荣坤等[4]在地方鸡江汉鸡进行净化研究中，结合企业育种实际选择了开产初期 22 周龄和留种前35周龄2个时间点来检测，经过2个世代的净化，p27抗原阳性率显著降低。俞燕等[5]对4个地方鸡种净化过程中，确定了1日龄、育雏转育成6周龄、开产初期(25～27周龄)、留种前2周(36～40周龄)等4个净化关键时间点。本研究，参照崔治中[3]推荐的技术方案，结合该鸡种生长特性及鸡场实际育种情况，选择种鸡生长阶段的1日龄、育雏后期(12周龄)、初产期(26周龄)、留种前(35周龄)4个时间点，通过多种检测方法联合应用的方式，增加了阳性鸡的检出率。

本研究中，核心保种群初产期血浆病毒分离率从第0世代的9.1%降至第3世代的0.50%，公鸡精液病毒分离率从第0世代的3.26%降至第3世代的0。在生产性能方面，经过4个世代的净化，种母鸡56周龄产蛋数平均净增8.95个。第3世代育雏期成活率、育成期成活率、产蛋期成活率较第0世代分别增长3.01%、2.17%和1.48%。繁殖性能方面，第3世代入孵蛋孵化率相比第0世代提升2.72%。俞燕等[5]对某地方鸡种进行3个世代的净化，25～27周龄蛋清p27抗原阳性率由26.4%降至0.3%，36～40周龄血浆病毒分离阳性率由36.4%降至0.4%，育雏期、育成期和产蛋期死亡率均逐级下降；产蛋性能方面66周龄总产蛋数平均增加了23个/只。关于禽白血病低水平感染的净化报道较少，本研究中部分生产指标虽有所增加，但增长趋势不显著，可能与鸡群本身处于低水平感染相关。通过禽白血病的净化，切实提升了该种鸡群的生产性能及繁殖性能，但其净化效果在商品代的表现，仍需要进一步追踪。对于不同的原种鸡场来说，没有一个完全相同的净化标准。净化方案的制定需要根据各场的基础设施建设及基本流调情况等实际情况进行制定。

禽白血病净化是一个综合性的工程，彻底完成净化除了需要科学有效的方案外，还需要持之以恒的检测以及严格的生物安全措施[6]。目前国内外检测和鉴别诊断ALV 的方法，主要包括病毒的分离与鉴定、病理学检测、血清学检测和分子生物学检测等[7]。病毒的分离与鉴定一直被认为是诊断ALV的金标准,该方法特异性高，但耗费时间较长，对操作人员的技术要求和检测中的仪器要求较高。国内大多数种鸡场不具备批量的病毒分离检测条件，需委托具有相应资质和条件的实验室承担。目前，适用于大规模流行病学调查和净化的检测方法主要还是针对ALV群特异性抗原p27的ELISA方法[8]。在市场需求和国家政策引导下，禽白血病净化将在全国得到更大范围的推广，临床上仍需要操作简单、灵敏度高、技术成熟的快速检测方法。同时，完善的生物安全体系建设和配套硬件设施是阻断横向传播或其他传播途径的有利保障。即使已经完成净化的种禽场仍旧面临多重感染途径的再感染风险，必须依靠完善的生物安全体系建设将疫病挡在门外[9]。科学的监测淘汰方法、规范的饲养管理制度、严谨的生物安全措施在疫病净化过程中缺一不可。

综上所述，研究选择多个净化关键检测节点，采用血浆和精液病毒分离、胎粪和蛋清禽白血病抗原检测等技术组合的方法检出并淘汰感染鸡，配合出雏期纸袋孵化、育雏期隔板阻挡等创新措施降低水平传播，制定符合上海市原种鸡场实际、具有可操作性的禽白血病净化技术方案，可为其他种鸡场净化工作提供参考。