猪源盖塔病毒Cap蛋白与E2蛋白多克隆抗体的制备及其免疫特性分析

苏靖茵，燕诗雨，张萌，粟硕

(南京农业大学免疫研究所，江苏 南京 210095)

盖塔病毒(Getah virus, GETV)是典型的虫媒病毒，最早于1955年从马来西亚的白雪库蚊中分离并命名，随后陆续又从猪群、马群中分离出该病毒。近年来，世界各国出现母猪感染零星病例，而在2017年中国湖南猪场出现母猪和仔猪盖塔病疫情[1]。临床上，GETV对猪和马的侵害性较大，他们的症状主要表现为发热、浮肿等[2]。GETV在国内外均有流行，且我国陆续报道除马、猪以外的多种动物(牛和狐狸等)感染病例[3]。

GETV是单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属的成员。GETV全基因组长11～12 kb，包含2个开放阅读框，分别编码非结构蛋白和结构蛋白。GETV的5个结构蛋白分别是C、E3、E2、6K和E1。在甲病毒中，Cap蛋白是一种多功能蛋白，包含N端RNA结合域和C端结构域[4]。Cap蛋白能与病毒基因组特性结合，这会影响病毒核衣壳形成和RNA合成[5]。此外，Cap蛋白不仅能促进核衣壳组装过程中Cap蛋白二聚作用，还能促进在出芽过程中与糖蛋白细胞质结构域的相互作用[6]。E2是糖蛋白，分子量约为50 kDa；pE2是E2的前体，能裂解成E2和E3[5]。在甲病毒粒子感染过程中，E2作为介导病毒进入宿主细胞的主要蛋白。

GETV的Cap蛋白与E2蛋白可能在病毒感染和病毒复制中起重要重要作用。但现今对于GETV的病毒蛋白与及致病机制等研究仍较少[7]，而GETV的抗体能促进其相关研究。因此，本文通过了原核表达Cap和E2蛋白并制备了GETV的多抗，以用于GETV的基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料

Vero、BHK细胞和pET-32a(+)载体均为本实验室保存。DH5α与BL21(DE3)感受态均购自康为公司。GETV由本实验室分离纯化后保存。6～8周龄雌性BALB/c小鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物公司。

限制性内切酶购自NEB公司；DNA Marker购自TaKaRa公司；胎牛血清、DMEM培养基、标准蛋白Marker均购自赛默飞公司；高保真DNA聚合酶、同源重组连接试剂盒，化学发光试剂(ECL)显色液均购自诺唯赞公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠抗体、HRP标记的山羊抗兔抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠的抗体均购自KPL公司；His兔源抗体购自ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

以GenBank中登录的GETV毒株NC_006558.1为参考毒株，设计E2基因糖蛋白区域和Cap基因编码区特异性引物。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 GETV-Cap基因和GETV-E2基因扩增引物

1.2.2 目的基因的扩增

Vero细胞长至80%～90%时，接种GETV，细胞出现病变后，加入TRIzol裂解细胞。按照TRIzol试剂说明书，提取细胞培养物中病毒的RNA。使用RT-PCR方法扩增Cap基因及E2基因，反应体系为50 μL，反应条件为：94 ℃，4 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，38 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物凝胶电泳后，回收目的片段。

针对水产品运输环节监管，2017年，佛山市建立鲜活水产品跨区域产销对接监管协作机制，与长沙市食安办、食药监、农业等部门联合签署《加强区域间鲜活水产品产销对接监管合作框架协议》。建立水产品质量安全联盟，以何氏水产为代表的10多家大型水产品经营企业共同建立了统一的“收贩运”质量标准体系，有效解决水产品运输环节非法添加问题。

1.2.3 原核表达质粒的构建

空载体pET-32a(+)经EcoRⅠ与HindⅢ双酶切后回收载体。使用同源重组酶将回收目的片段与回收后的载体连接。连接产物转DH5α，并涂布于含氨苄抗性的平板，37 ℃培养12～16 h。挑取单菌落，37 ℃扩培后，提质粒双酶切(EcoRⅠ与HindⅢ)鉴定。根据酶切鉴定的结果，将阳性克隆送公司测序，鉴定正确后获得质粒pET-Cap和pET-E2。

1.2.4 Cap与E2原核表达

将空载体pET-32a(+)、pET-Cap和pET-E2质粒分别转入BL21(DE3)感受态中，挑取单菌落获得pET-32a(+)、pET-Cap和pET-E2表达菌种。将pET-Cap 和pET-E2 菌种接种至含氨苄抗性的LB培养基中，37 ℃培养至菌液OD600值为0.6～0.8。摸索诱导条件分别为：诱导温度为37、25 和16 ℃；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0.5、1.0 和1.5 mmol/L；诱导时间为3、5和7 h。选取较优诱导条件，诱导后取菌体超声约30 min至菌体清亮。12 000 r/min离心，分离上清与沉淀。将沉淀溶于包涵体溶解液中，4 ℃过夜，具体操作参考文献[8]。SDS-PAGE分析pET-Cap和pET-E2原核表达蛋白主要分布于包涵体中。把原核表达蛋白经镍柱亲和层析纯化，通过SDS-PAGE分析纯化效果。纯化后的蛋白使用脲素梯度稀释法进行透析复性，4 ℃，12 h/次，前后经过复性液1～4，具体操作参考文献[9-10]。将复性蛋白和诱导空载体分别制备成蛋白样品，SDS-PAGE分析后，半干转至硝酸纤维素膜(NC膜)；5% 脱脂奶封闭后，孵育His抗体和HRP标记的山羊抗兔抗体，ECL发光显色。

1.2.5 小鼠多抗血清制备

复性的Cap和E2蛋白分别作为免疫原，经皮下背部多点方式，100 μg/只，免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠。首免免疫原和等体积完全弗氏佐剂乳化，而二免和三免用不完全弗氏佐剂替代完全弗氏佐剂。每次免疫间隔为2周，三免后1周采血，分离免疫小鼠血清作为阳性血清，不免疫小鼠血清作为阴性血清。ELISA测定血清效价，分别测定梯度稀释后的阳性血清效价，操作参照文献[11]，酶标仪读取各孔的OD值。

1.2.6 Westeron blot鉴定

BHK细胞以感染复数(MOI) 0.01接种GETV，细胞病变后48 h，制备接种与不接种GETV的蛋白样品，细胞裂解后收集样品，加入4×上样缓冲液后煮样。经SDS-PAGE分析后转至NC膜；封闭NC膜后，孵育Cap和E2 阳性血清一抗和HRP标记的山羊抗鼠二抗；洗膜后，ECL发光显色。

1.2.7 免疫荧光试验(IFA)鉴定

BHK细胞长至80%以上时，以MOI为0.01接种GETV，48 h后使用冰甲醇固定细胞。封闭后，分别与 E2、Cap血清和PBS(对照组)作用；接着以FITC标记的山羊抗鼠的抗体为二抗孵育，并使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，最后倒置显微镜下观察拍照。

2 结果与分析

2.1 PCR目的条带扩增与质粒构建

以GETV的cDNA为模板，通过Cap特异性引物，RT-PCR方法扩增出约800 bp的片段(图1A)，与GETV的Cap基因理论值(804 bp)相符；通过E2特异性引物，用RT-PCR方法扩增出约1 200 bp的片段(图1B)，与GETV的E2基因理论值(1 209 bp)大小一致。

M. DNA Marker DL2000；1. Cap基因；2. E2基因

2.2 重组质粒的构建与鉴定

同源重组酶将目的片段与双酶切(EcoRⅠ和HindⅢ)的pET-32a(+)连接，构建成重组克隆质粒。分别使用Cap和E2的特异性引物，以Cap阳性质粒和E2阳性质粒为模板，分别扩增出804 bp与1 209 bp的单一条带。质粒酶切鉴定结果显示，空载体酶切后可见大小为5 900 bp条带；Cap阳性质粒有5 900和804 bp 2条带；E2阳性质粒有2条分别在5 900和1 209 bp附近的条带，均符合预期(图2)。将阳性质粒送公司测序，测序结果与原始序列比对一致，分别命名为pET-Cap和pET-E2。

M1. DNA Marker DL2000；M2. DNA Marker DL5000；1.双酶切pET-Cap质粒；2.Cap基因扩增；3.双酶切空载体；4.双酶切pET-E2质粒；5.E2基因扩增；6.双酶切空载体

2.3 重组蛋白的表达与纯化

通过比较不同条件下诱导pET-Cap情况，最终选择诱导条件为：IPTG浓度为1 mmol/L，37 ℃，诱导3 h。诱导后包涵体中40～55 kDa附近有明显条带，而上清仅有少量蛋白，表明Cap蛋白主要在包涵体中大量表达(图3A)。包涵体中的蛋白经镍柱亲和层析纯化后获得重组Cap蛋白(图3B)。纯化复性后Cap蛋白样品与His抗体结合，在40～55 kDa附近有条带，纯化复性蛋白为重组Cap蛋白(图3C)。

A.pET-Cap表达：M.标准蛋白Marker；1. pET-Cap未诱导；2.pET-Cap诱导；3.pET-Cap超声后上清；4.pET-Cap超声后沉淀；B.Cap蛋白纯化：M.标准蛋白Marker；1.纯化pET-Cap沉淀；2.复性Cap蛋白；C.Cap蛋白与His抗体反应：M.标准蛋白Marker；1.复性Cap蛋白；2.pET-32a(+)诱导

通过分析比较不同温度、时间与不同浓度的IPTG诱导pET-E2的效果，IPTG浓度为1 mmol/L时，在25 ℃，诱导5 h下E2蛋白大量表达，55～70 kDa附近有蛋白带，且蛋白主要存在于包涵体中(图4A)。经镍柱亲和层析纯化和复性透析包涵体中蛋白后，获得重组E2蛋白(图4B)。纯化复性后的E2蛋白与His抗体反应，在55 kDa处有明显条带而空载体没有，表明纯化复性的蛋白为重组E2蛋白(图4C)。

A.pET-E2表达：1. pET-E2未诱导；2.pET-E2诱导；3.pET-E2超声后上清；4.pET-E2超声后沉淀；M.标准蛋白Marker；B. E2蛋白的纯化：1. 纯化pET-E2沉淀；2.复性E2蛋白；C. E2蛋白与His抗体反应：1.复性E2蛋白；2.pET-32a(+)诱导

2.4 Cap蛋白与E2蛋白多克隆抗体的制备

Cap与E2原核表达蛋白分别免疫小鼠制备多克隆抗体，经3次免疫后ELISA检测小鼠血清抗体效价，结果2种抗体效价均达到1∶105以上。

2.5 Western blot 验证多抗效果

GETV的Cap蛋白理论大小约为30 kDa，BHK(图5A)和Vero(图5C)细胞接种病毒后不同时间点的样品在25～35 kDa附近可见有明显条带，而不接种病毒样品未见条带，说明Cap多抗能与GETV发生特异性结合。

GETV的E2蛋白理论大小为46 kDa，其前体pE2为62 kDa。BHK(图6B)和Vero(图6C)细胞接种病毒后不同时间点的样品在40～55 kDa与55～70 kDa附近均可见明显条带，而不接种病毒样品未见条带，说明E2多抗与GETV的反应性良好。

M.蛋白标准Marker；1.BHK细胞接种GETV；2.BHK细胞不接种病毒

2.6 IFA验证多抗效果

GETV接种于BHK细胞，以Cap多抗和E2多抗为一抗进行IFA，均可检测到绿色荧光，而对照组没有绿色荧光，说明Cap多抗和E2多抗能特异性识别GETV(图6)。

图6 Cap和E2多抗与GETV反应性的IFA鉴定(标尺=500 μm)

3 讨论

GETV在我国广西、四川、云南、海南、河北、湖南和甘肃等多地均有报道，表明该病毒在我国普遍流行[12]。在自然界中，GETV是一种虫媒病毒，带毒蚊虫通过叮咬猪、马、鼠等易感动物，使病毒在这些动物体内增殖[13]。Li等[14]对家畜血清样本进行调查后，发现在鸡、鸭、奶牛、猪和肉牛中均能检测GETV的中和抗体，其中猪和肉牛抗体阳性率较高(46%～72%)。2010年在河北省涉县出现正常人群和发烧患者感染GETV情况，流行病学筛查后发现正常人群的总感染率高达16.67%，远高于海南琼中地区的阳性率(约2.0%)[15]。这说明GETV可能具有重要的公共卫生学意义。

近年来对甲病毒的功能报道较多，而GETV的报道相对较少。研究发现甲病毒囊膜蛋白E2存在糖基化位点、宿主细胞受体识别位点和中和抗体的识别位点[5]。甲病毒科辛德比斯病毒(Sindbis virus)E2蛋白单抗能够影响病毒在体内和体外的复制[16]。E2单抗处理后感染病毒，尽管细胞内核衣壳蛋白和囊膜蛋白仍持续合成，但病毒粒子释放减少[17]。甲病毒囊膜糖蛋白E2蛋白C端接触的是由Cap蛋白和基因组RNA组成的病毒核衣壳[6]。一旦核衣壳蛋白从初生的多肽链中释放出来，N端信号序列将发挥作用，导致糖蛋白pE2插入内质网[5]。甲病毒的Cap蛋白N端结构域虽保守性较低，富含正电荷。Cap蛋白存在核定位信号和核出口信号位点，在核胞质运输中发挥作用[18]。而Cap蛋白的C端蛋白酶结构域高度保守，Cap蛋白的114～264残基表面存在疏水区域，并被誉为疏水口袋。该口袋能与E2蛋白C端的16个残基相互作用[19]，该结合在甲病毒组装中发挥积极作用。

目前，国内外对于GETV的E2蛋白研究主要是基于原核表达E2蛋白并建立ELISA方法[20- 21]，而对于其抗体制备报道较少。E2与Cap蛋白抗体对研究GETV蛋白的功能起着重要的作用。姜焱等[22]成功制备了GETV的Cap蛋白多抗，但没有进一步验证Cap多抗与GETV的反应性。GETV的Cap蛋白与E2蛋白多抗不仅能应用于分离鉴定GETV，还能应用于流行病学调查。为深入了解GETV，本文制备了其鼠源Cap多抗与E2多抗，Western blot和IFA均证实此2种多抗均能特异性识别GETV，为进一步探究GETV致病机制提供了物质基础。