四川地区猪源戊型肝炎病毒感染的分子流行病学调查

张毅，陈斌，梁璐琪，邵靓，周明忠，裴超信，陈弟诗，丁梦蝶，陈冬

(四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041)

戊型肝炎是一种人畜共患传染病，由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)引起，人的发病以青壮年为主，病程4～6 周，死亡率0.5%～3%，临床可表现从亚临床感染到重度肝炎，对妊娠、慢性肝病、免疫缺陷、器官移植等特殊人群威胁重大[1]。对人易感的HEV仅有1个血清型，4个基因型[2]，其中基因1型、2型仅感染人，基因3型、4型则可感染人和猪、鼠等多种动物。猪是HEV主要的储存宿主和传染源，其感染HEV时不产生明显临床症状和病变，猪源HEV可能通过食用未煮熟的猪肉产品[3]、长期的职业暴露(屠宰场工人[4]、兽医[5])等途径传播给人，对于公共卫生安全是一种严重的潜在威胁。

HEV基因组全长约7.2 kb，目前已发现4个开放阅读框(open reading frame, ORF)。ORF1主要编码复制相关的非结构蛋白；ORF2和ORF3由病毒亚基因组的可选阅读框产生，分别编码衣壳蛋白和小免疫磷蛋白，ORF2编码的衣壳蛋白含有重要免疫表位，后者与细胞骨架相关；ORF4只在基因1型中发现，编码区位于ORF1内部，编码蛋白通过形成蛋白复合物参与病毒的复制[6]。

为了解四川猪源HEV流行特征，本研究对四川部分地区的屠宰场生猪进行HEV监测，并对HEV编码衣壳蛋白的ORF2部分序列进行同源性和系统进化分析，为HEV的防控策略提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2019年在四川省13个地区屠宰场采集的猪组织样品(淋巴结、肝)358份，-20 ℃保存。

1.2 主要试剂

MagMAXTMPathogen RNA/DNA Kit总核酸提取试剂盒，购自Thermo Fisher Scientific 公司; One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、Tks GflexTMDNA Polymerase、DL2000 DNA Marker等，购自宝日医生物技术有限公司。

1.3 引物、探针的设计与合成

荧光定量PCR(qRT-PCR)检测：参照文献[7]建立的方法进行。

套式RT-PCR(RT-nPCR)：根据GenBank中3型与4型HEV基因组序列，进行核苷酸比对分析，在HEV ORF2的保守区设计2对套式PCR引物HEV-out-F和HEV-out-R、HEV-in-F和HEV-in-R，终产物为ORF2 5′端长度为1 020 nt的部分序列(去除两端引物后为977 nt)。引物、探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，详见表1。

表1 HEV检测和序列扩增所用引物、探针

1.4 样品前处理

将每份样品的淋巴结、肝各剪取约0.01 g，混合后放入裂解介质管，加入800 μL PBS，使用组织匀浆仪匀浆1 min，8 000 r/min 离心2 min，取组织上清液200 μL进行总核酸提取。

1.5 核酸提取

使用MagMAXTMPathogen RNA/DNA Kit总核酸提取试剂盒，配合自动核酸提取仪提取组织上清液中的总核酸。总核酸置-70 ℃保存。

1.6 HEV的qRT-PCR检测

使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)进行qRT-PCR检测。反应体系为：10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，10 μmol/L探针0.5 μL，2×buffer 10 μL，反转录酶0.4 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，总核酸 2 μL，无核酸酶水4.7 μL。反应条件为：42 ℃，5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。出现特异性扩增曲线的样品判定为阳性。

1.7 HEV ORF2部分序列的扩增

选出qRT-PCR阳性样品的总核酸，使用设计的RT-nPCR方法分两步进行扩增。首先使用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2进行一步法RT-PCR，反应体系为：10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，RT-PCR反应液10 μL，酶混合物0.8 μL，总核酸 2 μL，无核酸酶水5.2 μL。反应条件为：50 ℃，30 min；94 ℃，2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，35个循环。随后用无核酸酶水对扩增产物进行100倍稀释，作为第2轮扩增DNA模板。使用Tks Gflex DNA Polymerase进行第2轮PCR扩增，反应体系为：10 μmol/L上游引物2.5 μL，10 μmol/L下游引物2.5 μL，Gflex反应液25 μL，Gflex DNA聚合酶1 μL，DNA模板2 μL，无核酸酶水17 μL。反应条件为：94 ℃，1 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，68 ℃ 30 s，30个循环。取第2轮PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，成功获得目的片段的样品送生工生物工程(上海)股份有限公司克隆测序。

1.8 HEV ORF2部分序列分析

将获得的HEV ORF2部分序列提交GenBank，从GenBank中获取禽源HEV 1株，HEV基因1、2、3、4型代表株26株，BLAST相似率最高的HEV毒株11株，共计38条HEV ORF2部分序列作为参考，使用Lasergene 7.0 的 MegAlign 模块的Clustal W方法进行核苷酸比对分析(不包括禽源HEV)，使用MEGA 7.0进行Neighbor-Joining法系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 屠宰场HEV核酸检测

qRT-PCR检测结果显示，屠宰场猪组织样品HEV总阳性率为4.75%(17/358)，61.54%(8/13)的地区有HEV阳性样品检出，不同地区阳性率为4.35%～44.44%。各地区检测结果见表2。

表2 HEV检测结果、阳性样品的毒株命名及GenBank登录号

2.2 ORF2部分序列RT-nPCR扩增

使用建立的RT-nPCR方法，17份阳性样品的ORF2部分序列均成功扩增，见图1。

2.3 HEV ORF2部分序列分析

2.3.1 同源性分析

17个四川HEV毒株的ORF2部分序列均长977 nt，与参考序列相比，未发生缺失和插入。提交GenBank，序列号为MT263364-MT263380。核苷酸比对分析发现，17个毒株序列之间同源率存在较大差异(85.4%～99.4%)。一些来自相同地区的毒株高度同源，如3个资阳株swSCzy2、swSCzy3、swSCzy4之间同源率高达99%～99.4%；但多数地区存在差异较大的毒株，如3个雅安株之间、资阳株swSCzy1和其他3个资阳株之间，同源性分别只有85.37%～87.5%和87.1%～87.4%。

M.DL2000 Marker；1～17.HEV阳性样品的ORF2产物

将17个四川毒株与37个参考序列比较，同源率为76.4%～97%，其中swSCcd1与基因4d型的中国猪源毒株CHN-SD-sHEV同源率最高为97%，swSCbz1、swSCnc1均与基因1型的印度人源毒株IND-HEV-AVH5-2010同源率最低为76.5%。swSCnj1等8个毒株与4a亚型代表株JKO-ChiSai98C同源率较高(91.6%～92.6%)，swSCya2等3个毒株与4b亚型代表株CVS-Sie10同源率较高(94.6%～95.6%)，swSCcd1等6个毒株与4d亚型代表株CH-YT-1同源率较高(94.7%～95.9%)。17个毒株中，有10株与人源毒株同源率超过95%，有6株与人源毒株同源率高于猪源毒株，同源率在94.6%～96%之间，与猪源毒株同源率更高的有11株，同源率在94%～97%之间，详见表3。

2.3.2 系统进化分析

如图2所示，HEV基因1～4型形成4个主要的进化分支，1型和2型由人源HEV毒株组成，3型和4型由人源、猴源、猪源、藏猪源等毒株组成，17个四川毒株的ORF2部分序列分别处于基因4型中的4a、4b和4d亚分支，3个亚分支均同时包含人源、猪源HEV毒株。其中swSCnj1、swSCnj2、swSCzy2、swSCzy3、swSCzy4、swSCya3、swSClz1、swSCnj3等8株，与4a亚型代表株JKO-ChiSai98C处于同一亚分支，划为4a亚型；swSCya2、swSCbz2、swSCzy1等3株与4b亚型代表株CVS-Sie10处于同一亚分支，划为4b亚型； swSCcd1、swSCnc1、swSCbz1、swSCpzh1、swSCcd2、swSCya1等6株与4d亚型代表株CH-YT-1处于同一亚分支，划为4d亚型。

表3 四川猪源HEV毒株同源性最高的猪源及人源HEV毒株

▲为本研究测定的毒株序列

3 讨论

我国是戊型肝炎高发地区，自2001年以来，人感染戊型肝炎呈上升趋势[8]。生猪是HEV的主要动物宿主和传染源之一，四川地区一些屠宰场设施自动化程度、生物安全水平较低，人感染HEV的风险需要评估。因此，有必要对生猪的带毒情况进行监测。由于抗体水平无法实时反映带毒情况，本研究采用敏感性高的荧光RT-PCR方法进行检测，结果表明四川13个地区中有8个地区的猪群存在HEV感染，地区分布较广，总阳性率为4.21%。与中国不同地区猪群HEV阳性率差异较大(2.25%～46.7%)[9-13]的情况相似，四川省也表现出地区间阳性率差异大的特征，为0～44.44%。其中阳性率在前位的资阳市、成都市、内江市均是四川省生猪交易频繁的地区，HEV阳性率可能与生猪流动频率相关，但还需进一步收集证据。

我国猪群主要流行HEV基因4型，其中4a和4d占主导地位，基因3型和基因4型的其他亚型也有报道。对17株HEV ORF2部分序列进行分析，核苷酸同源性为85.4%～99.4%，均为基因4型，其中4a亚型8株，4b亚型3株，4d亚型6株，与中国现在流行趋势一致[14-15]，而4b亚型也是四川[16]、广西[10]、广东[17]地区的优势基因亚型。本研究发现的4a和4d亚型毒株与四川甘孜藏猪源HEV毒株有较高同源性，表明猪源HEV遗传有较强的地域性特征。

目前已通过动物试验证实，猪源基因3型、4型HEV可感染非人灵长类，人源基因3型、4型HEV也可感染猪。从人医临床上看，欧洲、美国等国家主要流行基因1、3型[18]；我国主要流行基因1、4型，其中4型又以4a、4d、4h亚型为主[19]，四川猪源HEV优势亚型中的4a、4d与人源毒株亚型一致。本研究发现，17个四川猪源毒株中有10株与人源毒株同源率超过95%，有6株与人源HEV的同源率高于猪源，表明四川猪源HEV与我国主要流行的人源HEV遗传关系密切，具有较大的人畜共患风险，应提高防范意识，有针对性、系统性地进行预防和控制。