中华鳖睾丸界膜的组织学特性

丁佰韬，王琦，崇金星，陈畅，杨平

(南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

中华鳖，又名甲鱼，是一种古老的爬行类动物，也是我国养殖规模最大的爬行动物之一，鳖肉肥美鲜嫩，具有极高的营养价值，鳖甲常用作中药材，具有极高的医用和药用价值[1]。本实验室前期对中华鳖生殖特性的研究发现，中华鳖精子发生的季节性变化具有阶段性和过程特异性[2]。中华鳖是一种季节性繁殖动物，4～5年龄性成熟，精子发生开始于春季5月初，持续到秋季末，在冬季11月初精子一次性地被释放到附睾后，进入冬眠期，此时动物机体的体温、代谢等生理活动下降[3]，精子发生也进入停滞期；到春季，中华鳖各项生理活动缓慢复苏，生殖活动也进入精子发生初期，并在夏季达到精子发生的高峰期[4]。

界膜也被称为固有层、管周层、管周组织或边界组织[5]。它由最外层的成纤维细胞、中间的肌样成纤维细胞和最内层的细胞外基质组成。成纤维细胞可分泌一定的基质和纤维，以修复睾丸界膜。中层的肌样成纤维细胞有平滑肌细胞收缩的特性，以调节生精小管的压力，促进精子向附睾方向移动[6]，因此，肌样成纤维细胞可以表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)；肌样成纤维细胞还具有成纤维细胞的特性，分泌细胞外基质，影响支持细胞代谢，在睾丸间质细胞之间形成微循环；在病理状态下，肌样成纤维细胞还能够向成纤维细胞转化，以分泌基质和纤维。最内层的基质部分位于基膜和细胞之间，支持细胞和肌样成纤维细胞分泌的多种蛋白都在其中发挥生理学作用[7]。

目前关于睾丸的研究多聚焦于哺乳动物，如小鼠、人类等[2, 5-13]。对于爬行动物睾丸的研究较少，尤其是中华鳖睾丸界膜的季节性变化。本试验选用不同繁殖阶段的中华鳖睾丸，采用HE染色、马松染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化染色方法研究中华鳖睾丸界膜的季节性变化，为中华鳖睾丸界膜的深入研究，促进中华鳖常年繁殖的潜在应用提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别于2019年4月、12月，于南京水产市场采购5只成熟健康中华鳖，750～950 g/只。

1.2 光镜样品制备

将睾丸切割为小块组织，置于4%多聚甲醛固定48 h，上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，用莱卡切片机RM2455(Leica公司)制作石蜡切片(厚度5 μm)。

1.3 HE染色

苏木精染色1 min，伊红染色10 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。使用光学显微镜DP73(Olympus公司)观察中华鳖睾丸形态变化并拍照。

1.4 马松染色

用Weigert铁苏木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化液分化5～15 s，水洗后马松蓝化液返蓝3～5 min，水洗后丽春红品红染色液染色5～10 min，磷钼酸溶液洗1～2 min，再用配置好的弱酸工作液洗1 min，放入苯胺蓝染液中染色1～2 min，弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，每次5～10 s，二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性树胶封片。使用光学显微镜DP73(Olympus公司)观察中华鳖睾丸结缔组织变化并拍照。

1.5 甲苯胺蓝染色

睾丸切片入甲苯胺蓝染液5 min，水洗，1%的冰醋酸分化，自来水洗终止反应，显微镜下控制分化程度，自来水洗后，将切片置于烤箱烤干。二甲苯透明5 min，中性树胶封片。使用光学显微镜DP73(Olympus公司)观察中华鳖睾丸界膜内肥大细胞变化并拍照。

1.6 免疫组化染色观察

3% H2O2室温孵育10 min除去内源性过氧化物酶。0.02 mol/L PBS清洗5 min×3次，切片上滴加5% BSA室温孵育30 min。擦拭切片周围，用0.01 mol/L PBS溶液以1∶50的浓度稀释一抗并滴加α-SMA抗体(BM00022，武汉博士德生物公司)，4 ℃孵育过夜。次日，切片用0.02 mol/L PBS漂洗5 min×3次，滴加生物素标记的二抗(即用型快捷免疫组化试剂盒Kit-5001，福州迈新生物公司)，将切片放入湿盒中37 ℃孵育60 min，用0.02 mol/L PBS漂洗5 min×3次，滴加SABC复合物，37 ℃孵育30 min，0.02 mol/L的PBS漂洗5 min×3次，DAB显色8 min，蒸馏水洗5 min×3次，苏木精复染10 s，中性树胶封片。使用光学显微镜DP73(Olympus公司)观察中华鳖睾丸界膜内肌样成纤维细胞变化并拍照。

1.7 数据统计与分析

随机选取相同倍镜下的HE图片，使用ImageJ Pro测量图片积分光密度值(IOD值)，分析得到不同繁殖阶段中华鳖睾丸生精小管面积、生精上皮厚度、界膜面积、界膜厚度数据。使用SPSS 16.0进行统计学分析，采用t检验比较不同繁殖阶段中华鳖睾丸生精小管面积、生精上皮厚度、界膜面积、界膜厚度的差异，用GraphPad Prism 5.0作图，所得数据采用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 中华鳖睾丸形态学比较

通过HE染色观察到，冬眠期中华鳖睾丸生精小管管腔内的生精上皮由2～3层生精细胞构成，但生精细胞数量较少，初级精母细胞和精子细胞甚至消失，偶尔能看见生精小管管腔内有残存的上个生精周期的精子细胞(图1A)。生精小管管腔在冬眠期出现明显皱缩(图1A、图1B)，生精小管界膜内广泛分布血管、淋巴管及各种形态的细胞(图1A)，血管多围绕在生精小管周围(图1B)。界膜内不仅可见各种形态的细胞，还有紧贴在生精小管界膜的梭形细胞，以及存在于生精小管之间的睾丸间质细胞，睾丸间质细胞呈圆形或多边形，细胞质呈嗜酸性，常围绕血管周围(图1B)。

繁殖期中华鳖睾丸生精小管拥有明显扩张的管腔，管壁内衬5～8层生殖细胞的生精上皮，并形成从基底部开始向管腔部发出的放射状排列的精子柱。精子柱上排列着各级生精细胞(图1C、图1D)。繁殖期中华鳖睾丸生精小管周围血管变少，界膜厚度变薄(图1C)，在结缔组织内可见精子细胞(图1D)。

A.冬眠期鳖睾丸生精小管出现皱缩；B.冬眠期鳖睾丸生精小管周围血管、淋巴管较多；C.繁殖期鳖睾丸生精小管管腔扩张；D.繁殖期鳖睾丸界膜存在游离精子。ST.生精小管；BV.血管；LC.睾丸间质细胞；→.精子细胞

通过马松染色观察到，冬眠期生精小管之间以界膜隔开，界膜外存在大量胶原纤维，包围生精小管，并将生精小管与外部分隔开，胶原纤维内存在深染的细胞成分(图2A、2B)。繁殖期中华鳖睾丸间质内多是胶原纤维，且胶原纤维稀疏，细胞成分较冬眠期少(图2C、2D)，生精小管之间通过血管、结缔组织等连接。

通过甲苯胺蓝染色可清晰观察中华鳖睾丸界膜内的细胞形态。冬眠期时，胶原纤维淡染，可见大量的细胞成分，此时睾丸生精小管周围包绕多层肌样成纤维细胞细胞，通过甲苯胺蓝染色难见肥大细胞存在(图3A、3B)，但界膜分布有细长梭形状核的肌样成纤维细胞。繁殖期时，细胞成分减少，但生精小管基底部可见形态不同于冬眠期睾丸界膜的肌样成纤维细胞，此时肌样成纤维细胞的细胞核细长，胞体较大，有突起，分布于睾丸间质细胞周围，且光镜下分层不明显，此时肥大细胞仍难以见到(图3C、3D)。

A.冬眠期鳖睾丸疏松结缔组织包绕生精小管；B.冬眠期鳖睾丸界膜胶原纤维丰富；C.繁殖期鳖睾丸疏松结缔组织分布稀疏；D.繁殖期鳖睾丸胶原纤维内分布血管。ST.生精小管；BV.血管；CF.胶原纤维

A.冬眠期鳖睾丸胶原纤维淡染；B.冬眠期鳖睾丸生精小管外侧有多层肌样成纤维细胞；C.繁殖期鳖睾丸细胞成分较少；D.繁殖期鳖睾丸仅可见单层肌样成纤维细胞。→.肌样成纤维细胞

2.2 中华睾丸生精小管及界膜的面积及厚度比较

繁殖期中华鳖睾丸生精小管面积显著大于冬眠期(P<0.05，图4A)，生精上皮厚度极显著大于冬眠期(P<0.01，图4B)；冬眠期中华鳖睾丸界膜面积显著大于繁殖期(P<0.05，图4C)，界膜厚度极显著大于冬眠期(P<0.01，图4D)。从冬眠期到繁殖期，中华鳖睾丸生精小管面积增加，生精上皮厚度同样增加；界膜面积减少，界膜厚度同样减小。

A.不同繁殖阶段生精小管面积比较；B. 不同繁殖阶段生精上皮厚度比较；C.不同繁殖阶段界膜面积比较；D.不同繁殖阶段界膜厚度比较。*P<0.05表示差异显著；** P<0.01表示差异极显著

2.3 中华鳖睾丸肌样成纤维细胞变化比较

为进一步探究生精小管周围梭形细胞的分布与表达，使用α-SMA定位肌样成纤维细胞，其在不同月份的中华鳖睾丸表达定位也不相同。在冬眠期的中华鳖睾丸组里，α-SMA表达的肌样成纤维细胞在生精小管周围广泛呈弥散状，其细胞核细长，形成3～4层的网状结构包绕生精小管(图5A、5B)。在繁殖期中华鳖睾丸中，生精上皮管腔内仍排列着大量的游离精子，管腔基底部排列着发育中的生殖细胞和永久性的支持细胞(图5C)。α-SMA仍然在生精小管周围的界膜表达，呈网状结构包绕生精小管，也在睾丸间质细胞中少量表达，此时的睾丸间质细胞发育充分，环绕在肌样成纤维细胞周围。肌样成纤维细胞紧贴生精上皮表达，胞核细长，胞质呈长突起状(图5D)。

3 讨论

本试验采用HE染色、马松染色、甲苯胺蓝染色以及免疫组化试验对中华鳖睾丸界膜进行了分析。界膜是构成睾丸微环境的结构，能够调节精子的正常发生，也被人称为固有层、管周组织等[5]。界膜对于睾丸实质的物质交换起着重要作用，营养物质和代谢物都需要先通过界膜才能出入生精上皮。有研究认为界膜的内外层细胞皆具有物质运输功能，其中肌样成纤维细胞含有大量的吞饮小泡[8]。生精小管界膜能够有选择性地选择物质通过。促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、类固醇激素、水和葡萄糖较易通过，肌醇、氨基酸、蔗糖等则需要较长的通过时间，还有些物质则完全不可以通过。因此，有研究认为界膜是血-睾屏障的一部分[12]。

A.冬眠期鳖睾丸肌样成纤维细胞呈弥散状；B.冬眠期鳖睾丸肌样成纤维细胞的胞核及突起；C.繁殖期鳖睾丸成纤维细胞环绕生精小管；D.繁殖期鳖睾丸成纤维细胞连接生精小管和睾丸间质细胞。ST.生精小管；BV.血管；LC.睾丸间质细胞；→.肌样成纤维细胞细胞核；.肌样成纤维细胞突起；.多层的肌样成纤维细胞弥散分布；.血管平滑肌细胞

界膜的基膜和细胞之间的成分被称为细胞外基质(ECM)，ECM能够调控支持细胞的分化、代谢活动，维持支持细胞的正常结构和功能[9]。肌样成纤维细胞的分泌物是构成ECM的重要组分，如纤维连接蛋白、胶原纤维和生长因子等[14]，其中一些物质会影响支持细胞的功能[10]。如肌样成纤维细胞可参与维生素A的加工[15]。因此，肌样成纤维细胞能通过改变ECM的成分以调节支持细胞的结构和功能。因此，肌样成纤维细胞不仅为生精小管提供结构完整性，还参与精子发生和调节睾丸功能。

人们首先在哺乳动物物种中发现了围绕睾丸生精小管的肌样成纤维细胞，它们组成曲细精管的外细胞层，并与Sertoli细胞的基底面直接接触[6]。但它们在生精小管间质组织中的形态因物种而异。在啮齿动物中，包括大鼠、仓鼠和小鼠，在睾丸中仅见到一层肌样成纤维细胞，细胞之间由不同的结构连接。在人和一些其他动物的生精小管界膜中存在多层的肌样成纤维细胞[11]。这种由肌样成纤维细胞形成的边界组织有助于将生精小管与间质分开。

本研究在中华鳖的睾丸中观察研究肌样成纤维细胞的季节性变化。在冬眠期睾丸中，生精小管外存在类似人类睾丸的多层肌样成纤维细胞结构，这些细胞表达SMA。而在繁殖期的睾丸中，肌样成纤维细胞分层不明显，且不呈冬眠期状态的弥散式分布。这可能与肌样成纤维细胞影响睾丸精子的运输有关[16]。一方面，肌样成纤维细胞可以与其他细胞协同精子发生[17]；另一方面，ECM的沉积和肌样成纤维细胞的形态变化可能会导致雄性动物的不育症[18]。因此，深入了解肌样成纤维细胞在精子发生中的作用和调控机制，对于研究雄性不育症具有重要意义。

同时，在睾丸疏松结缔组织中，肥大细胞是一种常见的细胞类型，常沿淋巴管和小血管分布，在身体易于接触外界抗原的地方，肥大细胞分布广泛。在不同物种中，肥大细胞的数量也不一样，在马、猪和人睾丸中常发现肥大细胞；相反，兔睾丸内缺乏肥大细胞。另外，还有一些物种如大鼠、犬、猫、牛和鹿的睾丸实质中没有肥大细胞[10]。

在人睾丸中，肥大细胞的数量随着年龄改变而改变。婴儿期睾丸间质中的肥大细胞略有增加，但在儿童期减少，到了青春期增加明显，成年后睾丸结缔组织中肥大细胞的数量逐渐减少，这种数量的变化可能与睾丸结缔组织发育的变化有关[19]。在中华鳖睾丸中，巨噬细胞的分布与人类或大鼠睾丸区别明显。肥大细胞在不同物种的分布差异还有待进一步研究。

冬眠期鳖睾丸界膜厚度和繁殖期界膜厚度存在显著性差异，冬眠期中华鳖睾丸界膜厚度要极显著大于繁殖期中华鳖睾丸，这种界膜厚度的变化在哺乳动物不育症和正常生殖组中也有同样的表现。有文献报道，患生精障碍的人群中，精子发生的严重降低常伴随生精小管界膜增厚，在人类生精小管界膜中，结缔组织基质成分的异常扩张是导致生精小管增厚的主要原因[13]。有研究显示，生精功能严重减退的证据是减退患者睾丸结蛋白样免疫反应细胞的数量和强度明显减少，这是肌样成纤维细胞向成纤维细胞转化的表现[5]。而人和中华鳖睾丸具有相同结构的肌样成纤维细胞结构，这种结构基础以及季节性变化可能为研究生精障碍提供了潜在病理模型。

综上，本研究通过组织学观察和形态计量学分析，对不同繁殖阶段的中华鳖肌样成纤维细胞和界膜形态进行了研究，并观察到一定的变化，这种变化可能与其不同的生理繁殖期有关，为深入研究中华鳖繁殖机理奠定了基础。