采收期对膜荚黄芪叶茶生物活性成分的影响

黄保婷，陈垣，郭凤霞,2，杨豆豆

(1.甘肃农业大学农学院/甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室/甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室/甘肃省药用植物栽培育种工程研究中心，甘肃兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

黄芪为蒙古黄芪(Astragalusmembranaceusvar.mongholicus)或膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus)的干燥根，具有补气升阳、利水消肿，益卫固表、生津养血、行滞通痹之功效[1]，是我国传统中药之一。根据中国中药化学成分数据库，黄芪主要含有多糖、黄酮、多酚、蛋白质、氨基酸及微量元素等有效成分[2-4]，其中黄芪多糖具有抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫功能、调节血糖、保护心血管等作用[5-6]。黄芪总黄酮和多酚也具有一定的抗氧化作用[7-8]。黄芪的基原植物为豆科多年生草本药用植物，兼具生态、药用和饲用功能，目前主要开发其药用功能。

中药材根据药用部位不同，其最佳采收期也有差异[9]，黄芪药材根适宜采收期为秋末初冬[10]。最佳采收期采收时，其有效成分含量最高、外观形状和色泽最佳，品质最优。果盛期黄芪地上部分产量最高，黄芪甲苷含量最高[9]。黄芪因具有医疗和保健双重作用，已被增补列入我国药食同源中药材，即在限定剂量范围内既是药品又是食品的中药材物质，其需求量随着人们保健意识的增强愈来愈大。膜荚黄芪野生资源已趋濒危，药源主要由人工栽培，其传统药用部位为根部[1]。然而，膜荚黄芪植株高大，枝叶繁茂，栽培过程中大量的茎叶被遗弃，造成生物资源的浪费和对环境的污染。黄芪茎叶有一定药理作用[11]，叶茶是合理利用药用植物叶资源的有效途径，但至今有关膜荚黄芪叶资源开发利用相关的研究报道较少。因此，探寻膜荚黄芪叶资源开发利用途径具有重要意义，本研究将成药期不同生长时期采收的黄芪叶制作成叶茶，通过测定和比较各时期叶茶生物活性成分，为黄芪的综合开发利用提供科学依据，以提高膜荚黄芪叶资源的利用价值。

1 材料和方法

1.1 试验材料来源

供试原料采自甘肃会宁县膜荚黄芪成药栽培田，该区属于东南季风气候西北部边缘区(N 35° 40′,E 105° 21′ )，平均海拔1 970 m。经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为豆科植物膜荚黄芪。

仪器：电子分析天平，型号：FA1004，四川中浪科技有限公司。超声波清洗器，型号：SB25-12DTD,宁波新芝生物科技股份有限公司。湘仪冷冻离心机，型号：H-2050R，浙江赛德仪器设备有限公司。电热恒温水浴锅，型号：DK-98-II-s6，天津泰斯特仪器有限公司。岛津UV-2450分光光度计，岛津企业管理(中国)有限公司。电热鼓风干燥箱，型号：101-1AB，天津市泰斯特仪器有限公司。优普系列超纯水器，型号：UPD-1-201，四川优普超纯科技有限公司。JFSD-100粉碎机，上海嘉定粮油仪器有限公司。

药剂：浓硫酸、苯酚、无水乙醇、葡萄糖、无水碳酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、D(+)- 无水葡萄糖：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。甲醇：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。福林酚：分析纯，北京索莱宝科技有限公司。没食子酸：批号：110831-201605。芦丁标准品：批号：100080-201811。

1.2 叶收获及叶茶制备

膜荚黄芪成药栽培于2018年3月18日移栽，4月开始陆续返青，6月上旬出现花序并开始现蕾，7月上旬花蕾逐渐开放，7月中旬进入结果期。本研究从5月30日开始采摘新鲜黄芪叶，每隔15 d采收1次，至7月15日共采收4次。每次采收后，精选无病虫害健康的叶片按照绿茶加工工艺制成黄芪叶茶[12]，备用于生物活性成分测定。

1.3 膜荚黄芪叶茶多糖含量测定

叶茶多糖含量的测定按照葡萄糖标准曲线的绘制进行[12]，即首先配制100 mg/L的标准葡萄糖工作溶液，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于20 mL具塞试管中，用蒸馏水补足至1.0 mL。然后向试管中分别加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，混合均匀后，快速加入5.0 mL硫酸溶液，静置10 min，待反应液充分混合后，将试管置于30℃水浴中反应20 min，然后在490 nm处测定系列标准溶液的吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线(图1)，得回归方程：y= 0.249x- 0.034，相关系数R2=0.999。

测试叶茶样品制备：将0.2 g叶茶样品置于50 mL具塞离心试管中，用5 mL水浸润样品，缓慢加入20 mL无水乙醇，震荡使混合均匀，置于超声波提取器提取30 min。提取结束后，于4 000 r/min离心10 min，弃去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗涤、离心。用水将不溶物转入圆底烧瓶，加入50 mL水，超声提取30 min，重复2次。冷却至室温后过滤，将上清液转移至200 mL容量瓶中，残渣洗涤2～3次，洗涤液转移至容量瓶中，加水定容至200 mL。测定时吸取1.00 mL样品测定液于20 mL试管中，用于测定吸光度。以不加试样的测定液为空白对照。将测得试样溶液的吸光度代入标准曲线的回归方程，计算出多糖含量。

图1 葡萄糖溶液标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose solution

1.4 膜荚黄芪叶茶总黄酮含量测定

黄芪叶茶总黄酮含量按照标准曲线制备法进行[13]：吸取1.0，1.2，1.4，1.6，1.8和2.0 mg/mL芦丁标准溶液，分别置于25 mL 具塞比色管中，用60%乙醇溶液补充至5.0 mL，加50 g/L的亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入100 g/L的硝酸铝溶液1.5 mL，摇匀，放置6 min，最后加入200 g/L的氢氧化钠溶液4 mL，用60%乙醇溶液定容，摇匀，放置15 min。以试剂空白调节零点，在波长510 nm处测定吸光度。以吸光度值对应含量绘制标准曲线(图2)，得回归方程：y=0.294x+0.005,相关系数R2= 0.999。

叶茶样品制备[14]：将0.1 g样品与3 mL 95%乙醇在50℃下混合，超声提取3次，每次30 min，然后以4 000 r/min离心10 min，将上清液转移到10 mL容量瓶中。在510 nm下测量反应的混合物。将吸光度值用芦丁标准曲线转换为含量。

图2 芦丁溶液标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin solution

1.5 膜荚黄芪叶茶多酚含量测定

叶茶多酚含量测定按照标准曲线制备进行[15]：吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 μg/mL的没食子酸标准液各1 mL，置于带刻度的试管内，分别依次加入10%的福林酚试剂5.0 mL，摇匀，待反应8 min后，加入7.5%的碳酸钠溶液4.0 mL，摇匀。室温下静置1 h，在765 nm波长下用分光光度计测定吸光值并制作标准曲线(图3)。得回归方程：y= 0.478x+0.047，相关系数R2= 0.999。

测试样品制备[14]：将0.1 g粉末样品在70℃下用3 mL 70%甲醇悬浮，通过超声波提取3次，每次10 min，然后以3 500 r/min离心10 min，将上清液转移到10 mL容量瓶中。使用岛津UV-2450分光光度计在760 nm下测量反应混合物。将吸光度值用没食子酸表示的标准曲线转换成含量。

1.6 膜荚黄芪叶茶浸出物含量测定

浸出物含量按照GB/T 8305-87[16]的基本标准进行，称取 (3±0.001) g黄芪叶茶粉碎样品，置于500 mL干燥锥形瓶中，加入沸腾蒸馏水450 mL，立即置于沸水浴中，浸提45 min，每隔10 min震荡1次。浸提后乘热减压过滤，滤液移入500 mL容量瓶中，残渣用少量沸腾蒸馏水洗涤2～3次，合并滤液，冷却后用蒸馏水稀释至刻度线。测定时准确吸取滤液50 mL，注入蒸发皿后置于沸水浴上蒸干水分，然后置于105℃恒温烘箱烘干、称重，再置于烘箱干燥至恒重，冷却后称量。每个试样做2个平行样。

图3 没食子酸标准曲线Fig.3 Standard curve of gallic acid

1.7 数据统计分析

采用SPSS 20.0统计软件进行方差分析和相关分析，多重比较选用LSR法。

2 结果与分析

2.1 采收期对膜荚黄芪叶茶多糖含量的影响

采收期对膜荚黄芪叶茶多糖含量有影响，随采收时间延后叶茶多糖含量呈上升趋势。在4个不同时期采收的叶茶多糖含量为4.98%～7.80%。其中，7月15日采收的叶茶多糖含量最高，5月30日采收的多糖含量最低，两者差异显著(P<0.05)，6月15日和6月30日采收的叶茶多糖含量差异性不显著，但两者均与5月30日和7月15日采收的叶茶多糖含量差异性达显著水平(P<0.05) (表1)。

2.2 采收期对膜荚黄芪叶茶总黄酮含量的影响

在5月30日至6月30日随生长期的延后，膜荚黄芪叶茶总黄酮含量逐渐增高，7月后显著下降，总黄酮含量在15.73%～17.06%，6月30日采收的黄芪叶茶总黄酮含量最高，7月15日采收的叶茶总黄酮含量最低，两者差异显著(P<0.05)，相差1.32%。

2.3 采收期对膜荚黄芪叶茶多酚含量的影响

不同采收期的膜荚黄芪叶茶总多酚含量略有不同(P>0.05)，其中6月15日采收的黄芪叶茶多酚含量最高，5月30日采收的黄芪叶茶多酚含量最低，两者差异不显著(P>0.05)，相差1.139%。分期4次采收叶茶多酚含量变幅为3.88%～5.79%，变异系数11.28%(表1)。

2.4 采收期对膜荚黄芪叶茶浸出物含量的影响

膜荚黄芪叶茶中水和醇溶性浸出物含量均随采收期延后呈逐渐上升趋势，其中，水溶性浸出物含量的升高程度达显著水平(P<0.05)，但醇溶性浸出物含量的升高程度未达到显著水平(P>0.05)。4次采收水浸出物含量变幅为46.50%～50.67%，变异系数2.63%；醇浸出物含量46.84%～48.84%，变异系数1.40%。5月30日采收的叶茶浸出物含量最低，7月15日采收的叶茶浸出物含量最高(表1)。

表1 不同采收期的黄芪叶茶有效成分

2.5 采收期对膜荚黄芪叶茶总抗氧化活性物质及总浸出物含量的影响

黄酮类、多酚类和多糖类均是在生物体内具有较强抗氧化性的生物活性物质，水溶性和醇溶性浸出物反映出一定的营养成分，膜荚黄芪叶茶所检测的总抗氧化成分随采收期延后呈现先增高后下降的趋势，6月30日采收的叶茶抗氧化活性成分含量最高(29.46%)，较返青期5月30日采摘的叶茶提高13.32%，较6月15日采摘的叶茶提高4.31%，其差异均达到极显著水平(P<0.01)；较7月15采摘的叶茶提高2.18%，两者差异不显著(P>0.05)(图4)。

在5月下旬至7月中旬采收，膜荚黄芪叶茶总浸出物含量随采收时间延后呈持续波动增高的变化趋势(图4)。叶片营养成分随植株个体由营养生长向生殖生长过渡处于持续积累中。7月15日采收的叶茶总浸出物含量最高，较6月30日采摘的叶茶提高1.93%，较6月15日采摘的叶茶提高2.55%，但差异性均未达到显著水平(P>0.05)；较5月30采摘的叶茶提高4.75%，且两者差异性达到显著水平(P<0.05)。

图4 不同采收期膜荚黄芪叶茶总抗氧化活性成分和总浸出物含量变化动态Fig.4 Dynamic changes of the total antioxidant components and the total extract contents in leaf tea from Astragalus membranaceus harvested at different stages

4次采收的叶茶平均黄酮含量为16.49%，平均多糖含量为51.34%，平均多酚含量为5.23%，平均水浸出物含量为48.83%，95%的置信区间为47.76%～50.67%，平均醇浸出物含量为47.62%，95%的置信区间为47.06%～48.18%，醇溶性浸出物含量更为稳定。

2.6 膜荚黄芪叶茶生物活性成分间的相关与回归分析

相关分析显示 (表2)，在测定的5种生物活性成分中，水浸出物和醇浸出物与总黄酮含量相关性均未达显著水平(P>0.05)，与多酚含量的相关性很弱。多糖含量与水浸出物含量呈极显著正相关(P<0.01)，与醇浸出物和多酚含量呈正相关，与黄酮含量呈负相关，但相关性均未达显著水平(P>0.05)。水浸出物与醇浸出物含量与多酚含量分别呈现正相关，但相关性均未达显著水平(P>0.05)。水浸出物与醇浸出物含量间也呈正相关(P>0.05)(表2)。

表2 膜荚黄芪叶茶生物活性的相关分析

对膜荚黄芪叶茶水浸出物含量与多糖含量的线性回归分析显示(图5)，两指标呈极显著直线回归关系，直线回归方程为y= 42.487+0.989x(R2=0.818**，P<0.05)，即在一定范围内，可由水浸出物含量估测多糖含量，估测结果可靠。

图5 膜荚黄芪叶茶水浸出物含量与多糖含量间的直线回归分析(n=8)Fig.5 Linear regression between polysaccharide content and water extracts in leaf tea from Astragalus membranaceus harvested at different stages (n=8)

3 讨论

3.1 采收期对膜荚黄芪叶茶具有显著影响，影响程度随生物活性成分而异

生物活性物质是指生物体内产生且对生命活动具有影响的微量或少量化学成分。浸出物和黄酮是茶叶内含有的重要营养物质，黄酮类和多酚在抗氧化和抗衰老方面具有重要作用，其含量的高低影响着茶叶品质[14,17]。由于植物生长发育阶段和生理状态的不同，造成生物活性成分多糖、黄酮等的转化和积累量在各器官的分布不同[18]。本研究中，成药期6月后膜荚黄芪进入旺盛营养生长期，繁茂的枝叶为其叶产品的开发奠定了良好的叶资源基础，植株生长发育过程中，叶片的大小和健康状况受外界气候条件和自身的生理状态影响较大，7月中旬前膜荚黄芪病虫为害少，7月下旬至8月中旬盛夏季受外界高温及干旱胁迫导致植物叶片失水，严重影响叶片外观质量，故本研究在5月下旬至7月中旬分4次采收叶片制成叶茶，通过测定叶茶主要生物活性成分，发现采收期对膜荚黄芪叶茶内在和外在品质均具有很大影响，不同生长期叶茶生物活性成分含量随采收时间和活性成分的不同而异，多糖和浸出物含量随采收期延后逐渐增加，黄酮、多糖和多酚含量总计依次为6月30日(29.46%)>7月15日(28.83%)>6月15日(28.25%)>5月30日(26.00%)；水和醇溶性浸出物含量总计依次为7月15日(98.65%)>6月30日(96.78%)>6月15日(96.19%)>5月30日(94.17%)。还可能是随着日照时数延长，光强增大，气温升高，膜荚黄芪进入营养旺盛期，营养物质积累量增大，但7月后温度的持续升高导致干热胁迫，使叶功能活性下降，这与田间观察的结果一致。因此，膜荚黄芪叶茶最佳采收期为6月30日至7月15日。此期采摘茶品质较好、主要生物活性成分含量基本达到最高值。这一现象在甜柿叶茶和苦丁茶等茶产品中均有体现[19-21]。

3.2 膜荚黄芪叶茶具有较多的生物活性成分，活性成分间具有内在关联

本研究中，分4次采收的膜荚黄芪叶茶中，总黄酮、多糖和多酚含量合计为28.14%，水溶性浸出物平均含量为48.83%，醇溶性浸出物含量稳定性更强，平均含量为47.62%，水和醇溶性浸出物含量均远高于《药典》标准(水浸出物不得少于17.0%)。两种浸出物合计为96.45%，说明膜荚黄芪叶茶含有较多的生物活性成分。在5月30至7月15日分4次采收叶茶的平均黄酮含量为16.49%，较唐文文等[10]对黄芪根的测试结果高出8.70%。另外，平均多糖含量为51.34%，平均多酚含量为5.23%。膜荚黄芪这些活性成分间还具有一定的关联，浸出物含量高有利于多糖和多酚含量的积累，但不利于黄酮类物质的积累。

4 结论

膜荚黄芪叶茶生物总活性成分随采收试验延后逐渐增多，在5月下旬至7月中旬采收总生物活性含量差异不显著，说明生物活性总含量稳定性较强，但各活性成分含量随采收期的延后表现出很大的差异性，黄酮含量随采收期延后呈先极显著增高后又下降趋势，6月30日叶茶总黄酮含量最高(17.06%)。多糖和浸出物含量均随采收期延后呈显著递增趋势，7月15日采收的叶茶多糖含量最高(7.80%)。6月采收的多酚含量保持在稳定高的水平(5.50%～5.65%)。这些生物活性成分间具有一定的内在关联，浸出物含量与多糖含量呈直线回归关系(y=42.487+0.989x(R2=0.818**，P<0.05)，两者呈极显著正相关(R2= 0.905**，P<0.05)。以上结果表明膜荚黄芪绿叶期长，更适宜叶茶的开发。综合考虑各生物活性，以6月30日至7月15日为最佳采收期。