湿热中阻方对脾胃湿热证小鼠氧化应激和炎症因子影响研究

段继昌，曹 路，柴晶美，魏 岩，周丽雅

（长春中医药大学基础医学院，长春 130117）

近年来，随着高脂、高糖等饮食摄入的增加，脾胃湿热证的患者逐年增多。湿热中阻方是周丽雅教授临床治疗脾胃湿热证的自拟方，临床治疗多种与脾胃湿热相关的疾病取得了良好的临床疗效。脾胃湿热证主要有脘腹痞闷、厌食油腻、呕恶纳呆、大便臭晦黏腻、小便黄、苔腻等症状，常见于慢性乙型肝炎[1]、慢性胃炎[2]、胃癌[3]、肝癌[4]、溃疡性结肠炎[5]等多种消化系统疾病，具有病机复杂、缠绵难愈、治疗难度大等特点[6]。研究[7]显示，脾胃湿热证的发病机制与炎症病变密切相关。炎症反应是一种自我防御过程，但过度的炎症反应会对机体造成损伤，引发疾病。现代研究[8-10]表明，脾胃湿热证的脾胃组织存在大量炎症浸润和不同程度的ROS 损伤，氧化应激可能是引起脾胃功能病变的原因之一。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取6～8 周龄，SPF 清洁级昆明小鼠60 只，体质量18～20 g [辽宁长生生物科技有限公司，许可证号SCXK（辽）2019-005]。

1.2 药物及主要试剂 湿热中阻方方药组成：黄连10 g，姜厚朴15 g，制半夏10 g，淡豆豉10 g，焦栀子15 g，石菖蒲15 g，海螵蛸15 g，白及10 g，瓦楞子15 g，芦根30 g，长春中医药大学附属医院；RIPA 裂解液（P0013B），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（P0012S），活性氧检测试剂盒（DCFH-DA,S0033M），上海碧云天生物技术有限公司；乳酸脱氢酶试剂盒（LDH,A020）、超氧化物歧化酶测定试剂盒（SOD,A001）、丙二醛测定试剂盒（MDA,A003）、谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒（GSH-Px）、过氧化氢酶测定试剂盒（CAT,A007），南京建成生物有限公司；白介素-6（IL-6,BMS603HS）、肿瘤坏死因子（TNF-α,BMS607HS），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；羊抗兔IgG [Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP,ZJ2020-R]、羊抗鼠IgG [Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP,ZJ2020-M]，Bioworld Technology 公司；极超敏ECL 化学发光即用型底物（AR1191），武汉博士得生物工程有限公司；引物序列（COX2、iNOS、HO-1、β-Actin），生工生物工程（上海）股份有限公司；p-P38MAPK（4511）、p-NF-κB（3039）、p-IKBα（2859）、HO-1（43966）、GAPDH（5174），Cell Signaling Technology（CST）公司。

1.3 方法

1.3.1 药物制备 湿热中阻方按照《医疗机构中药煎药室管理规范》的煎煮方法制备，药液低温浓缩至每1 mL 药液中含生药量1.2 g（根据《中药药理学》人鼠等效剂量换算），4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 分组与造模 小鼠适应性饲养1 周后，区分雌雄，随机分成6 组，分别为空白组，湿热模型组，黄芩滑石汤组，湿热中阻方低、中、高剂量组，每组10只，雌雄各半。空白组普通饲料喂养，实验组予高脂高糖饲料喂养，即在普通饲料喂养的基础上，加用200 g/L 蜂蜜水自由饮用，且隔日按小鼠体质量灌服油脂10 g/kg，并与油脂隔日灌服10 mL/kg 白酒（红星二锅头56°，北京红星股份有限公司），共30 d。

1.3.3 动物给药 空白组：常规饲养，每日10:00 定时投放食物和水，温度25～28℃、湿度70%～80%。湿热模型组：采用内因湿热法造模，在造模之前12 h开始禁食不禁水。用高脂高糖饲料和蜂蜜水喂食。造模成功后，生理盐水灌胃，每日1 次。湿热中阻方低、中、高剂量组：造模成功后，予小鼠湿热中阻方灌胃，每日1 次。阳性药组：造模成功后，黄芩滑石汤灌胃，每日1 次。共治疗7 d。给药期间自由进食、饮水。每天观察其一般情况，记录精神状态、进食、活动和大便情况。

1.3.4 标本采集 取材前1 天开始禁食不禁水，取材前禁食24 h。眼球取血1 mL，静置1 h 后以3 000 r/min离心10 min，取上层血清置于EP 管中，于-20℃冰箱中保存待测。小鼠眼球取血后，脱颈处死，剪取胃窦，上述组织各取一半置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 以上，另一半置于液氮中冷冻保存。

1.4 指标检测

1.4.1 一般情况观察 观察小鼠的生理状况，如精神状态、皮毛色泽、活动度、大便性状等。每日测量小鼠的肛温和体质量，进食量和进水量。

1.4.2 iNOS mRNA、HO-1 mRNA、COX-2 mRNA 表达水平测定 1）取胃组织加入匀浆管中，加入4 ℃的RNA later；加入250 μL 三氯甲烷，在低温环境下，以12 000 r/min 离心10 min，取上清液，加入异丙醇，-20℃放置15 min。在低温环境下，继续以12 000 r/min 离心10 min，收集管底白色沉淀物，即为总RNA。2）引物：引物序列见表1。3）荧光定量PCR：取7.5 μL 反应体系于95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s 扩增40 个循环，扩增后对产物作溶解曲线，每个样本重复3 次。

表1 PCR 引物序列表

1.4.3 血清生化指标检测 取胃组织约0.5 g，冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称定质量，剪碎，冰浴匀浆，制成10%组织匀浆，4 000 r/min 低温离心10 min，取上清液待测。取离心后的上层血清，按照试剂盒说明书检测血清中SOD、MDA、CAT、GSH-Px、IL-6、TNF-α、LDH、ROS 的含量。

1.4.4 Western blot 法分析胃窦p-P38MAPK、p-NF-κB、p-IKBα 表达水平 取胃窦组织，用预冷的PBS 洗涤2～3 次，裂解液裂解，12 000 r/min，4 ℃，离心10 min，收集上清液待测。将蛋白溶液按照4:1 的比例加入还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴15 min 变性，灌胶后加入SDS-PAGE 电泳，将蛋白转印到PVDF 膜上。将转印完的膜放入TBST 孵育槽中，室温下封闭30 min，加入相应一抗4 ℃孵育过夜，再加二抗室温孵育30 min，ECL 显色，拍照。Alpha 软件分析结果。

1.5 统计学方法 运用SPSS 25.0软件进行统计分析，数据均以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般状况 空白对照组小鼠精神状态良好，皮毛有光泽，反应灵敏，活动自如，大便正常。湿热模型组小鼠出现嗜睡懒动，反应迟钝，皮毛无光泽，大便溏腻等表现。湿热中阻方治疗后，上述症状逐渐改善。

2.2 湿热中阻方对LDH释放的影响 与空白对照组比较，湿热模型组小鼠LDH释放量显著升高（P＜0.001），LDH 是胃肠组织损伤的标志物，说明脾胃湿热模型形成；与湿热模型组比较，湿热中阻方中、高剂量组小鼠LDH 释放量明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；湿热中阻方低剂量组LDH 释放量明显降低，但无显著性差异；与湿热模型组比较，阳性药组LDH 释放量显著降低（P＜0.001）。结果表明，湿热中阻方能够抑制脾胃湿热引起LDH 的释放，缓解胃肠组织损伤。见图1。

图1 湿热中阻方对LDH 释放的影响

2.3 湿热中阻方对ROS 释放的影响 与空白对照组比较，湿热模型组ROS 生成显著上升（P＜0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方低、中、高剂量组ROS生成受到显著抑制（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），阳性药组ROS 生成量受到显著抑制（P＜0.001）。结果表明，湿热中阻方可以降低脾胃湿热刺激的胃细胞内ROS的水平，调节胃细胞氧化还原体系的平衡。见图2。

图2 湿热中阻方对ROS 释放的影响

2.4 湿热中阻方对氧化应激因子CAT、GSH-Px、MDA、SOD 释放的影响

2.4.1 湿热中阻方对CAT 释放的影响 与空白对照组比较，湿热模型组CAT 生成量明显降低（P＜0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方中、高剂量组CAT 生成量明显升高（P＜0.001）；湿热中阻方低剂量组CAT 生成量明显升高（P＜0.05）；阳性药组CAT 生成量显著升高（P＜0.001）。结果表明，湿热中阻方可以升高体内CAT 的生成量，增强对自由基的清除能力，抑制氧化应激。见图3。

图3 湿热中阻方对CAT 释放的影响

2.4.2 湿热中阻方对GSH-Px 释放的影响 与空白对照组比较，湿热模型组GSH-Px 生成量明显降低（P＜0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方高剂量组GSH-Px 生成量明显升高（P＜0.01）；湿热中阻方低、中剂量组GSH-Px 生成量明显升高，但无显著性差异；阳性药组GSH-Px 生成量明显降低（P＜0.001）。结果表明，湿热中阻方可以升高体内GSH-Px 的生成量，增强对自由基的清除能力，抑制氧化应激。见图4。

图4 湿热中阻方对GSH-Px 释放的影响

2.4.3 湿热中阻方对MDA 释放的影响 与空白对照组比较，湿热模型组MDA生成量明显升高（P＜ 0.05），说明氧化自由基产生增加，抗氧化能力减弱；与湿热模型组比较，湿热中阻方高剂量组MDA 生成量明显降低（P＜0.05）；湿热中阻方低、中剂量组MDA 生成量明显降低，但无显著性差异；阳性药组MDA 生成量受到显著抑制（P＜0.05）。结果表明，湿热中阻方可以抑制脾胃湿热证引起的机体脂质过氧化程度，抑制氧化应激。见图5。

图5 湿热中阻方对MDA 释放的影响

2.4.4 湿热中阻方对SOD 释放的影响 与空白对照组比较，湿热模型组SOD 生成量明显降低（P＜0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方中、高剂量组SOD 生成量明显升高（P＜0.01，P＜0.001）；湿热中阻方低剂量组SOD 生成量明显降低，但无显著性差异；阳性药组SOD 生成量受到显著抑制（P＜0.001）。结果表明，湿热中阻方可以升高体内SOD 的生成量，增强对自由基的清除能力，抑制氧化应激。见图6。

图6 湿热中阻方对SOD 释放的影响

2.5 湿热中阻方对炎症因子IL-6、TNF-α 释放的影响 与对照组比较，湿热模型组IL-6、TNF-α 释放量显著升高（P＜0.01），说明脾胃湿热证小鼠体内炎症因子含量升高；与湿热模型组比较，湿热中阻方高剂量组IL-6、TNF-α 释放量显著降低（P＜0.01，P＜0.05），湿热中阻方中剂量组IL-6、TNF-α 释放量显著降低（P＜0.05），湿热中阻方低剂量组IL-6、TNF-α释放量明显降低，但无统计学差异；与湿热模型组比较，阳性药组IL-6、TNF-α释放量显著降低（P＜0.01）。结果表明，湿热中阻方能降低炎症因子的含量，减轻炎症反应。见图7。

图7 湿热中阻方对IL-6、TNF-α 释放的影响

2.6 湿热中阻方对iNOS mRNA、HO-1 mRNA、COX-2 mRNA 表达的影响

2.6.1 湿热中阻方对iNOS mRNA 表达的影响 与空白对照组比较，湿热模型组iNOS mRNA 的表达量显著升高（P＜0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方高剂量组的表达量显著降低（P＜0.001）；湿热中阻方中剂量组的表达量显著性降低（P＜0.01），湿热中阻方低剂量组的表达量明显降低，但无显著性差异；与湿热模型组比较，阳性药组的表达量显著降低（P＜ 0.001）。结果表明，湿热中阻方能抑制炎症介质iNOS mRNA 的表达，减轻炎症反应。见图8。

图8 iNOS mRNA 的表达量

2.6.2 湿热中阻方对HO-1 mRNA 表达的影响 与空白对照组比较，湿热模型组HO-1 mRNA 表达量显著升高（P＜ 0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方高剂量组表达量显著降低（P＜0.01）；湿热中阻方低、中剂量组表达量明显降低，但无显著差异；与湿热模型组比较，阳性药组表达量显著降低（P＜0.01）。结果表明，湿热中阻方能抑制炎症介质HO-1 mRNA的表达，减轻炎症反应。见图9。

图9 HO-1 mRNA 的表达量

2.6.3 湿热中阻方对COX-2 mRNA 表达的影响 与空白对照组比较，湿热模型组COX2 mRNA 的表达量显著升高（P＜0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方高剂量组的表达量显著性降低（P＜0.01），湿热中阻方中剂量组的表达量显著降低（P＜0.05），湿热中阻方低剂量组的表达量明显降低，但无显著性差异；与湿热模型组比较，阳性药组的表达量显著降低（P＜0.001）。结果表明，湿热中阻方能抑制炎症介质COX2 mRNA 的表达，减轻炎症反应。见图10。

图10 COX2 mRNA 的表达量

2.7 湿热中阻方对蛋白表达的影响 与空白对照组比较，湿热模型组小鼠P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα蛋白表达量显著升高（P＜0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方高剂量组蛋白表达量均显著降低（P＜0.01，P＜ 0.001，P＜0.001）；与湿热模型组比较，湿热中阻方中剂量组P-p38MAPK、P-IKBα 蛋白表达量显著降低（P＜ 0.05，P＜0.001），对P-NF-κB 的蛋白表达量无显著差异（本数据有明显错误，故排除）；与湿热模型组比较，湿热中阻方中、高剂量组P-NF-κB、P-IKBα 蛋白表达量显著降低（P＜0.001），P-p38MAPK 蛋白的表达量无显著差异；与湿热模型组比较，阳性药组蛋白表达量均显著降低（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。结果表明，湿热中阻方能抑制p38MAPK、NF-κB、IKBα 信号通路，降低活化的P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα 含量。见图11，表2。

图11 湿热中阻方对P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα蛋白表达的影响

表2 湿热中阻方对P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα 蛋白表达的影响

3 讨论

脾胃湿热证的临床表现主要是消化系统的炎症反应，大量炎症细胞浸润胃组织并释放炎症介质，炎症介质刺激ROS 释放，产生氧化应激反应。脾胃湿热证产生的ROS 可进入血液循环而使外周血中ROS 含量增加[11]，机体产生氧化应激反应，氧化-抗氧化系统的平衡被打破，ROS 表达过量[12]，进而刺激机体释放大量促炎因子，产生严重的炎症反应，导致胃黏膜的结构和功能损伤[13]。

本研究结果表明，脾胃湿热模型组的ROS、LDH含量增高，CAT、SOD、GSH-Px 含量降低，说明脾胃湿热证激活小鼠氧化应激反应，增加细胞损伤。脾胃湿热模型组的炎症调控因子P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα 蛋白表达水平较空白对照组显著升高，其进入细胞核激活多种促炎转录因子如HO-1 mRNA、COX2 mRNA、iNOS mRNA 表达，从而促进炎症细胞的浸润与活化，使IL-6、TNF-α 表达量升高，加剧胃组织损伤。脾胃湿热证形成后，大量炎症细胞浸润胃组织并释放炎症介质，炎症因子的表达破坏了氧化-抗氧化系统之间的平衡，氧化应激能促进TNF-α、IL-6 等炎症介质的表达[14-15]，炎症细胞活化后产生更多的ROS，导致炎症性病变后的氧化应激水平升高。氧化因子MDA、LDH 增多，抗氧化因子CAT、GSH-Px、SOD减少，生成过多的ROS，ROS 的增加被认为是氧化应激的主要原因。且ROS 增多能够继续激活氧化通路，使氧化损伤不断扩大。

中焦脾胃为枢机之地，湿热之邪阻滞中焦，则中焦气机不通，治法当恢复脾胃生理功能。湿热中阻方以辛开苦降法为组方原则，辛以化浊，苦以降浊，脾升胃降，则功能自复。脾胃湿热证小鼠经过湿热中阻方治疗后，氧化因子MDA、ROS、LDH 的含量降低，抗氧化因子CAT、GSH-Px、SOD含量升高，P-p38MAPK、P-NF-κB、P-IKBα 蛋白表达量降低，HO-1 mRNA、COX2 mRNA、iNOS mRNA 的含量降低，炎症因子IL-6、TNF-α 含量降低，说明湿热中阻方可以通过抑制氧化应激，进而抑制炎症因子的表达。

综上所述，脾胃湿热证与炎症之间关系密切，湿热中阻方对脾胃湿热证小鼠具有一定治疗作用。湿热中阻方能够通过清除LDH、ROS，降低炎症因子MDA 的表达，增加抗氧化因子SOD、CAT、GSH-Px的表达，降低氧化应激水平来改善脾胃湿热证小鼠炎症反应。