金纳米棒对小鼠乳腺癌细胞光热/光动力协同治疗的研究

胡雅晴,武云云,李兵,李奚

金纳米棒对小鼠乳腺癌细胞光热/光动力协同治疗的研究

胡雅晴,武云云,李兵,李奚*

长春工业大学化学与生命科学学院, 吉林 长春 130012

为研究金纳米棒（Au NRs）对小鼠乳腺癌细胞（4T1）光热/光动力协同治疗的影响。首先，通过调节硝酸银溶液（AgNO3）的加入量，制备6种不同长径比、不同表面电荷的Au NRs 1~6。然后，通过光热升温实验和细胞内/外ROS生成实验对Au NRs的光热和光动力性质评估，并对光诱导细胞损伤分子机制探究。结果表明，在NIR激光的照射下，Au NRs具有相似的温度升高水平，并显示出良好的光热性能。关于光动力学性质，细胞毒性评估表明，Au NRs在不同表面电荷的影响下对4T1细胞具有不同的杀伤效果。表面电荷的强度使Au NRs具有不同程度的细胞内在化和ROS生成能力，从而引起细胞损伤。因此，Au NRs对癌细胞具有光热/光动力协同治疗的作用，在癌细胞的光治疗方面，显示出巨大的潜力。

金纳米棒; 乳腺癌; 协同治疗

癌症已成为世界面临的最严重的公共卫生问题之一。研究人员一直在努力开发更准确快速的诊断策略和有效的治疗方法来对抗癌症。近年来，各种类型的纳米材料已经在生物医学领域被广泛应用，特别是光敏纳米材料在癌症光治疗中的应用。作为光治疗最有效的方法，光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）都是利用光敏剂吸收光能对目标组织进行治疗[1]。在PTT中，光敏剂在特定波长的光照射后，可以选择性地局部加热，并利用热量引起癌细胞或组织损伤。然而在PDT中，光敏剂在光照后变得不稳定并且可以吸收能量，从激发态返回基态的过程中能量被转移到周围的氧分子或基质中，这种能量的转移导致形成了活性氧（ROS），例如超氧化物（O2•-），羟基自由基（HO•）和单线态氧（1O2）。而过量的ROS会触发细胞损伤，并最终导致癌细胞死亡[2]。

金纳米材料具有独特的光学性能和理想的生物相容性。金纳米棒（Au NRs）具有良好的可控的表面化学性质和强大的局部表面等离子体共振（LSPR），在近红外（NIR）光区（650~900 nm）中具有很强的吸收和散射作用。当暴露在近红外激光下时，Au NRs附近的入射光的场效应得到增强，并且LSPR谱带中的自由电子会感觉到电场的存在并开始振荡，之后高能量电荷通过化学和能量转换过程促进和增强ROS的产生[3]。由于在电子-声子弛豫过程中释放的热量，金纳米棒结构具有光热特性[4]。金纳米棒可以在近红外激光照射下同时显示出PTT和PDT的性能，实现精确的协同治疗，具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

本文所用化学试剂购自Simga公司。4T1细胞购自ATCC。细胞培养基，胎牛血清，胰蛋白酶-EDTA，青霉素和链霉素购自Merck Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 Au NRs 1~6的合成在形状导向表面活性剂CTAB的存在下，通过种子生长法合成Au NRs[5]。其中，通过改变AgNO3溶液的体积得到六种不同长径比的Au NRs 1~6。

1.2.2 Au NRs的光热性质测定将含有1 mL 100 μg‧mL-1Au NR 1~6的石英比色皿暴露于的808 nm激光（0.75 W·cm-2，10 min，下同）下，记录溶液的温度变化

1.2.3 Au NRs的光动力性质测定使用2',7'-二氯荧光素（DCF）荧光确定总ROS[6]的生成。测定490 nm激发下的DCF荧光发射光谱（波长范围500~600 nm）。

1.2.4 细胞摄取实验通过电感耦合等离子体光谱（ICP-OES）表征4T1细胞对Au NRs 1~6的内吞能力。

1.2.5 细胞在光照/非光照条件下活性检测通过MTT法分析评估4T1细胞的活力。

1.2.6 细胞活/死染色将细胞与Au NRs 1~6共同孵育，在有/无808 nm激光照射下，用钙黄绿素-AM和碘化丙啶（PI）染色，并通过荧光显微镜观察。

1.2.7 蛋白质印记分析血红素加氧酶-1(HO-1)和热休克蛋白(HSP 70)的表达将细胞与Au NRs 1~6共同孵育，在有/无808 nm激光照射下，裂解细胞提取蛋白。通过Bradford方法测定蛋白质含量。通过SDS-PAGE电泳和化学发光成像系统检测目标蛋白。

1.2.8 细胞内ROS检测细胞与Au NRs 1~6共同培养，在有/无808 nm激光照射下，加入H2DCFDA在37 °C条件下孵育。收集细胞并使用FACS-Calibur流式细胞仪进行分析。

1.2.9 检测线粒体膜电位和超氧化物的产生细胞和Au NRs 1~6共同孵育，在有/无808 nm激光照射下，用Hoechst 33258对细胞核染色，并用JC-1和Mitosox Red对细胞染色。在Olympus BX-51光学系统显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 Au NRs 1~6的合成及理化性质的表征

Au NRs 1~6的形貌由SEM图像表征，Au NRs 1~6的长径比（AR）分别为2.9，3.4，3.6，3.7，3.9和4.2（见图1-A~F）。由图1（G）可见，通过调节AgNO3的体积，将Au NRs 1~6的纵向LSPR峰调整为750 nm~900 nm。Zeta电势表征溶液中纳米系统的表面电荷和稳定性，由图1（H）可见，Au NRs 1~6的负表面电荷分别为37.9±4.3、48.4±2.6、59.7±4.4、45.2±3.6、39.9±2.9和35.9±2.1。

图 1 Au NRs 1~6的SEM图像（A~F）、Au NRs 1~6的UV-Vis光谱（G）、Au NRs 1~6的 Zeta电位（H）

2.2 对Au NRs 1~6的光热性能的分析

由图2可见，Au NRs 1~6的温度在照射808 nm激光后迅速升高，温度升高（ΔT）分别为36.3、36.1、35.8、35.9、35.8和36.4 °C，显示出良好的光热性能。但是，没有Au NRs存在时，水的温度仅升高4.0 °C。

图 2 Au NRs 1~6的温度升高曲线（A）、加热/冷却曲线（B）

2.3 对Au NRs 1~6的光动力性质的分析

当没有808 nm激光照射时，Au NRs 1~6都不会增加DCF的荧光强度，表明纳米粒子没有使ROS产生（见图3-A）。但808 nm激光照射后，在Au NRs 1~6中检测到DCF的荧光强度显著增加，表明Au NRs中产生了大量的ROS（见图3-B）。

图 3 Au NRs 1~6的ROS生成能力无808 nm激光照射（A）、有808 nm激光照射（B）

2.4 Au NRs 1~6的体外光治疗效果的验证

如图4（A）所示，Au NRs 3由于携带最多的正电荷，被细胞吸收的程度更高。通过MTT评估Au NRs 1~6的体外治疗效果，结果发现，当不用NIR激光照射时，所有Au NRs在细胞中均未显示毒性（见图4-B）；但是，NIR激光照射后，Au NRs 1~6使细胞活力大大降低（见图4-C）。活/死细胞染色分析获得了与MTT一致的结果（见图4-D）。其中，Au NR 3显着降低了4T1细胞的活力，显示出最强的细胞损伤作用，主要是由于Au NR 3的Zeta电位引起更强的细胞内在化。由此可得，Au NRs 1~6的光治疗效果与光热/光动力性质一致，证明细胞吸收的纳米粒子数量对光治疗效果有重要影响。

图 4 细胞对Au NRs 1~6的摄取（A）、无NIR激光照射下4T1细胞的存活率（B）、有NIR激光照射下4T1细胞的存活率（C）、细胞活/死染色分析（D）

2.5 Au NRs光诱导细胞损伤的分子机制

如图5所示，没有近红外激光照射时，Au NRs 1~6不能诱导HSP 70和HO-1的表达（见图5A），在细胞内也没有检测到DCF荧光（见图5C），更不会引起线粒体功能障碍（见图5E）；但在近红外激光照射下，所有Au NRs都触发了HSP 70和HO-1的表达（见图5B），过量ROS的生成致使DCF产生荧光（见图5D），同时引发的线粒体超氧化物的产生和线粒体膜的去极化显著增加，其中Au NRs 3表现出最强的细胞杀伤效果。

图 5 膜电位和线粒体超氧化物的产生

3 讨论

在本研究中，改变AgNO3的添加量以控制Au NRs的长径比，并通过种子介导的方法合成了6个不同的Au NRs。在Au NRs中，CTAB形成带电头基朝外的双层结构，使得Au NRs带正电，因此它们能在水溶液中稳定存在[7]。细胞对纳米颗粒的吸收可以看作是其与细胞膜结合和内在化的两个过程[8]。细胞膜主要由磷脂双分子层和带负电的蛋白质组成，可促进带正电的Au NRs静电吸附到细胞膜上，这表明细胞摄取带正电的金纳米粒子的程度高于相应的阴离子纳米颗粒[9]。而具有不同长径比的Au NRs带有不同量的正电荷，受细胞表面带负电荷糖衣[10]的影响，六种Au NRs的细胞内化程度不同。根据细胞对Au NRs的不同摄取，在808 nm的近红外激光照射下检测了它们的PDT / PTT性能，并验证了它们在4T1细胞中的光治疗效果。

4 结论

综上所述，在808 nm激光照射下，Au NRs具有相似的温度升高水平，表现出较好的光热性能。而对于光动力学性质，所有这些金纳米结构在NIR激光激活下，都对4T1细胞表现出氧化应激损伤。其中Au NRs 3具有最强的细胞内在化程度和最高的ROS生成能力，从而引起最严重的细胞损伤。六种不同长径比的Au NRs在近红外激光照射下，都具有良好的光治疗效果，并具有优异的生物相容性，表现出巨大的肿瘤治疗的潜力。

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Study on the Photothermal/Photodynamic Synergistic Therapy for Breast Cancer Cells from Mice by Gold Nanorods

HU Ya-qing, WU Yun-yun, LI Bing, LI Xi*

130012,

To study the effect of gold nanorods (Au NRs) on the photothermal/photodynamic synergistic treatment of mouse breast cancer (4T1) cells. First, six Au NRs with different aspect ratios and surface charges were prepared by adjusting the amount of silver nitrate solution (AgNO3). Secondly, the photothermal and photodynamic properties of Au NRs were evaluated through the photothermal heating experiment and the intracellular/extracellular ROS generation experiment, and the molecular mechanism of light-induced cell damage was explored. The results show that under the irradiation of NIR laser, Au NRs have a similar temperature rise level and show good photothermal performance. Regarding the photodynamic properties, the cytotoxicity evaluations show that Au NRs have different killing effects on 4T1 cells under the influence of different surface charges. The strength of the surface charge makes Au NRs have varying degrees of cell internalization and ROS generation capabilities, which can cause cells damage. Comprehensive analysis shows that Au NRs has a photothermal/photodynamic synergistic therapy effect on cancer cells, and shows great potential in the phototherapy of cancer cells.

Gold nanorods; breast cancer; synergistic therapy

Q599

A

1000-2324(2021)02-0247-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.015

2020-10-14

2020-11-25

胡雅晴(1996-),女,硕士研究生,研究方向:生物纳米材料. E-mail:424705772@qq.com

Author for correspondence. E-mail:xli@ccut.edu.cn