3种植物提取物对稻瘟病菌的抑菌活性及其抑菌机理研究

梁 琪，付歆崴，李云鹏，杨胜甫

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

稻瘟病是由稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)引起的水稻病害，属于一种世界性稻作病害，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失达10%～30%[1]。近10年来，稻瘟病在中国局部地区暴发流行，实际造成稻谷损失超过50万t[2]。因此，稻瘟病的防治研究一直是学界关注的重点。水稻稻瘟病的防治主要采用以选育高抗、丰产的优良水稻品种为核心，结合改良的农业栽培管理技术和有效的化学防治，辅以越冬病原源头杜绝的综合防治策略[3]。但是抗病品种存在选育时间长和抗病性易丧失的问题[4]，在应用中不能完全满足需要；而化学农药易残留，会对环境造成污染，对人类机体造成有害影响[5]。所以寻找安全、环境友好型、经济高效的新型稻瘟病菌抑菌剂已经成为水稻生产中待解决的关键性问题[6]。

张逍遥等[7]认为生物农药具有选择性强，对人畜及非靶标生物安全、环境中易降解等优点。利用生物农药防治稻瘟病是水稻产业可持续发展的需要[8]。因此，开发利用植物源农药，已成为防治稻瘟病的一条重要途径。Wang等[9]研究表明，千层金(Melaleuca bracteata)提取物对稻瘟病菌的半抑菌浓度(EC50)为33.78 ± 2.35 μg/mL。Rout等[10-11]利用木橘(Aeglemarmelos)提取物合成的杀菌剂对稻瘟病菌孢子萌发的抑制率达到81.9%，对叶瘟的田间防效达到76%～80%。王云峰等[12]分别用100μmol/L和400μmol/L茉莉酸预先喷雾水稻，6 h后再接种稻瘟病菌株孢子，其诱抗效果分别为16.02%和25.51%；而以100 μmol/L和400 μmol/L茉莉酸制备稻瘟病菌株孢子悬浮液直接喷雾水稻，其诱抗效果分别为21.82%和34.09%。彭玉萌等[13]研究表明，无患子中果皮总皂苷提取物可以强烈抑制稻瘟病病菌的活性。虽然利用植物源农药防治稻瘟病取得了一定的进展，但是对植物源农药抑菌机理方面的研究尚有待加强。

本课题组从大量对人体安全、对环境友好的植物中，筛选得出几种具有显著抑制稻瘟病菌的提取物：黄连、甘草和肉桂。黄连(Coptischinensis)是中国传统中药，其抑菌谱较广，无论是对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，还是对真菌，均具有良好的抑菌效果[14]。甘草(Glycyrrhizauralensis)是豆科多年生植物，可以药食两用，有很好的医疗保健价值[15]。肉桂(Cinnamomumcassia)作为中国药食同源的传统药物及香料，具有多种药理作用，对心血管系统、消化系统等具有保护作用，主要表现在扩张血管、抗胃溃疡、抑菌、抗氧化等方面[16]。但有关这三种植物提取物对稻瘟病菌的抑菌机理研究尚鲜见报道。基于此，本试验以稻瘟病菌为防治对象，在进一步研究黄连、甘草、肉桂3种植物材料抑菌活性的基础上，通过菌丝扫描电镜(SEM)观察、相关生理指标分析，探讨其对该病菌菌丝体形态和生理过程的影响，为开发防治稻瘟病的新型植物源杀菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 供试的3种植物材料为黄连、甘草和肉桂，均购于哈尔滨泰景中西大药房。

1.1.2 供试菌株 供试病原菌为稻瘟病菌，由黑龙江大学现代农业与生态环境学院实验室分离鉴定并保存。试验在黑龙江大学现代农业与生态环境学院实验室，于2019年9月—2020年12月进行。

1.2 制备方法

1.2.1 植物提取液制备 将植物材料分别粉碎过40目筛，各称取20 g，加入100 mL浓度为80%的乙醇溶液，超声波振荡提取60 min，减压抽滤，滤液于40℃旋转蒸发浓缩为浸膏，以50%的乙醇溶液定容至植物材料干样1 g/mL，为提取物菌丝生长试验母液；以5%的吐温80溶液定容至植物材料干样1 g/mL，为提取物菌丝电镜观察试验母液，于4℃的冰箱中密封保存。

1.2.2 稻瘟病菌的活化及培养基的制备 按常规方法制作马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，对保存于试管中的稻瘟病菌进行平板活化培养，菌丝毒力测定使用添加2 g琼脂及96 mL葡萄糖马铃薯汁液的培养基。

1.3 菌丝毒力测定

采用生长速率法进行测定[17]。用50%乙醇作为稀释溶液，分别配置质量浓度为5、10、20、30、40 mg/mL的各提取物。分别向已制备的96 mL用于毒力测定的培养基中加入4 mL上述质量浓度的各提取液，以加入4 mL的50%乙醇为对照，平均倒入4个培养皿中，中间接种直径0.865 cm的菌饼，于26℃恒温培养箱内暗培养，培养120 h时进行菌落直径测定。每处理选取菌落直径较接近的3皿计算菌丝生长抑制率。

1.4 菌丝生理指标测定

分别制备3种提取物含2%乙醇的EC50浓度提取液，以2%乙醇作为对照，采用硫代巴比妥酸法测定菌丝丙二醛含量[18]；采用外渗电导法测定菌丝细胞膜透性[19]；采用可见光分光光度法测定菌丝丙酮酸含量[20]；采用考马斯亮蓝G-250法测定菌丝可溶性蛋白含量[21]。

1.5 扫描电镜观察

参照潘潇涵[22]的方法，用5%吐温80溶液作为稀释溶液，分别配置质量浓度为4.17 mg/mL的黄连提取液、4.48 mg/mL的甘草提取液和5.22 mg/mL的肉桂提取液。分别向已制备的96 mL的培养基中加入4 mL上述质量浓度的各提取液，以加入4 mL的5%吐温80溶液为对照，平均倒入4个培养皿中，中间接种直径0.865 cm的菌饼，于26℃恒温培养箱内暗培养120 h。从培养完成的平板中分别切取2×5 mm的小条，并用小刀切薄琼脂部分，留下菌丝面，便于后续观察。样品加入2.5%戊二醛固定1.5 h，然后用0.1 mol、pH 7.2的磷酸缓冲液冲洗2次，每次10 min。使用乙醇进行梯度脱水，用100%乙醇：叔丁醇=1:1溶液和纯叔丁醇溶液继续冲洗，两者各1次，每次15 min。将样品放入-20℃冰箱冷藏30 min，放入冷冻干燥箱干燥4 h。对样品喷金后，将处理好的样品放入样品盒中待检。

1.6 数据处理

数据基本处理采用Microsoft Excel软件；方差分析和Duncan多重比较、毒力回归方程和EC50计算均采用DPS统计软件，图片采用Origin绘图软件。

2 结果与分析

2.1 3种提取物对稻瘟病菌菌丝生长抑制作用

由表1可知，3种提取物对稻瘟病菌菌丝生长均具有较强的抑制活性。在3、4、5、10 mg/mL 4个质量浓度下，黄连提取物的菌丝生长抑制率显著高于甘草提取物和肉桂提取物的菌丝生长抑制率。但在20 mg/mL的质量浓度下，3种提取物对稻瘟病菌菌丝生长抑制率无显著性差异，菌丝生长均可被完全抑制。

表1 3种提取物的5个质量浓度对稻瘟病菌丝生长抑制率 %

由表2可知，3种提取物对稻瘟病菌菌丝生长毒力如下：黄连EC50＜甘草EC50＜肉桂EC50，黄连提取物在较低浓度下抑菌活性明显优于其他两种提取物，其EC50值为4.17 mg/mL，甘草提取液次之，EC50值为4.48 mg/mL，肉桂提取液EC50值为5.22 mg/mL。

表2 3种提取物对稻瘟病菌丝生长的毒力

2.2 3种提取物对稻瘟病菌菌丝体内丙二醛含量的影响

在细胞遭遇逆境条件下，一般会发生膜脂过氧化作用，丙二醛是产物之一，可将其作为细胞膜受损的重要指标[23]。由图1可知，经3种提取物处理后的稻瘟病菌菌丝，其丙二醛含量均与对照组的菌丝丙二醛含量具有显著性差异。黄连、甘草和肉桂提取物处理组丙二醛含量分别为2.179 μmol/g、2.162 μmol/g 和2.136 μmol/g，对照组丙二醛含量为2.066 μmol/L。上述结果表明，3种提取液处理组的稻瘟病菌菌丝丙二醛含量显著高于对照组，证明3种提取物处理组的细胞膜发生了膜质过氧化作用。

图1 3种提取物对稻瘟病菌丝体内丙二醛含量的影响

2.3 3种提取物对稻瘟病菌菌丝细胞膜通透性的影响

细胞膜作为细胞的屏障，起到一定的防御作用，在细胞膜遭到破坏时，细胞内的电解质会外渗[24]。由图2可知，随着处理时间的延长，3种植物提取物和对照组的菌丝电解质渗出率都在升高，前5 min电解质渗出率增幅较大，10 min后，电解质渗出率增幅开始放缓。经3种提取物处理后的菌丝电解质渗出率明显高于对照组的菌丝电解质渗出率，当处理时间为5 min时，黄连、甘草和肉桂提取物处理组的电解质渗出率分别为：83.45%、81.34%和77.78%，对照组电解质渗出率为75.81%。当处理时间为10 min时，黄连、甘草和肉桂提取物处理组的电解质渗出率分别为：84.89%、83.58%和80%，对照组电解质渗出率为77.04%。当处理时间为80 min时，黄连、甘草和肉桂提取物处理组的电解质渗出率分别为：89.93%、88.06%和82.22%，对照组电解质渗出率为78.52%。上述结果表明，3种提取液处理组的稻瘟病菌菌丝电解质渗出率高于对照组，证明3种提取物对菌丝细胞膜透性具有一定的影响，破坏了其半透膜性质。

图2 3种提取物对稻瘟病菌丝细胞膜通透性的影响

2.4 3种提取物对稻瘟病菌菌丝丙酮酸含量的影响

丙酮酸是细胞糖代谢途径中具有关键作用的产物，与菌丝的生命活动息息相关[25]。由图3可知，经3种提取物处理后的稻瘟病菌菌丝，其丙酮酸含量均与对照组的菌丝丙酮酸含量具有显著性差异。对照组丙酮酸含量为0.149 mg/g，肉桂、甘草和黄连提取物处理组丙酮酸含量分别为：0.143mg/g、0.140mg/g和0.136mg/g。上述结果表明，3种提取物处理组的稻瘟病菌菌丝丙酮酸合成受到的抑制作用较强，所以处理组的菌丝丙酮酸含量低于对照组，证明3种提取物干扰了菌丝的正常生命活动。

图3 3种提取物对稻瘟病菌丝体内丙酮酸含量的影响

2.5 3种提取物对稻瘟病菌菌丝可溶性蛋白含量的影响

可溶性蛋白是细胞中的生物大分子之一，在病菌受到胁迫的情况下，电解质外泄，同时菌丝体内的可溶性蛋白也向外渗出[26]。由图4可知，经3种提取物处理后的稻瘟病菌菌丝，其可溶性蛋白含量均与对照组的菌丝可溶性蛋白含量具有显著性差异。对照组可溶性蛋白含量为3.13 mg/g，肉桂、甘草和黄连提取物可溶性蛋白含量分别为：1.87 mg/g、1.41 mg/g和0.73 mg/g。上述结果表明，3种提取液处理组的稻瘟病菌菌丝可溶性蛋白含量显著低于对照组，原因可能是菌丝可溶性蛋白发生外渗，也可能是菌丝内可溶性蛋白合成遭到抑制。

图4 3种提取物对稻瘟病菌丝体内可溶性蛋白含量的影响

2.6 3种提取物对稻瘟病菌菌丝形态的影响

为了进一步探究3种提取物对稻瘟病菌的抑制作用，通过扫描电镜(SEM)对不同处理下的稻瘟病菌菌丝进行观察。如图5所示，在放大2000倍下，对照(a)菌丝表面较光滑饱满，分布均匀，生长情况健康；黄连提取物处理(b)菌丝表面粗糙、细胞壁皱缩，分布不再均匀；甘草提取物处理(c)菌丝表面褶皱较多，呈缢缩扭曲，分布不再均匀；肉桂提取物处理(d)菌丝表面出现褶皱，整条菌丝出现多处皱缩，部分菌丝甚至出现断裂的情况。

图5 3种提取物对稻瘟病菌丝形态的影响（扫描电镜2.00kx）

如图6所示，在放大10000倍下，对照(a)菌丝较直长舒展，表面平滑饱满，菌体生长健康。黄连提取物处理(b)菌丝表面极其粗糙，褶皱增多，膨大溃烂，菌丝的丝状结构崩解，黏连在一起，形成片层状结构；甘草提取物处理(c)菌丝粗糙呈褶皱状、干瘪变形；肉桂提取物处理(d)菌丝多处皱缩扭曲，整条菌丝被分割成多段。3种提取物对菌丝形态结构具有不同程度的破坏作用，使稻瘟病菌菌丝发生原生质泄露，从而影响菌体的正常生长。

图6 3种提取物对稻瘟病菌丝形态的影响（扫描电镜10.00 kx）

3 讨论与结论

目前，已有很多学者开展了利用植物源杀菌剂防治稻瘟病的研究。马尾松提取物对稻瘟病菌的EC50值为19.38 mg/mL；姜提取物对稻瘟病菌的EC50值为39.78 mg/mL[27]。质量浓度200 mg/mL的单叶蔓荆子种子粗提物，在接菌后24 h，对稻瘟病菌菌丝生长的抑菌活性为83.56%[28]。汪金莲等[29]研究发现，随着茶多酚浓度的增加，其对稻瘟病菌抑制作用增强，5.00 mg/mL和10.00 mg/mL时抑制率高达100%。本试验发现，黄连、甘草和肉桂提取物在较低浓度下对稻瘟病菌菌丝生长即有较强的抑制作用，3种提取物对稻瘟病菌菌丝生长的EC50值均低于10 mg/mL。在20 mg/mL浓度下，3种提取物对稻瘟病菌菌丝生长的抑制率均可达到100%。

目前，许多关于利用植物源杀菌剂防治病害的研究还停留在初步筛选抑菌活性阶段，而探索植物提取物的抑菌机理可为绿色抑菌剂的开发提供理论依据[30]。本试验发现，经提取物处理的病菌菌丝，丙二醛含量显著增加，说明病菌细胞发生了膜质过氧化，电解质渗出率在各时间段内均高于对照，说明提取物造成病菌细胞膜一定程度的破坏，可见细胞膜是黄连、甘草和肉桂提取物作用的主要部位之一；丙酮酸含量显著降低，可能是提取物对其合成或代谢产生了影响，可见提取物对病菌细胞合成与代谢活动产生了干扰；可溶性蛋白含量降低，可能是提取物提高了细胞膜通透性，导致菌体可溶性蛋白流失，也可能是可溶性蛋白合成遭到了提取物的抑制；提取物对菌丝超微形态产生了明显影响，黄连、甘草和肉桂提取物对稻瘟病菌菌丝的作用程度不同，但大体上均是通过破坏菌体形态，最后导致菌体畸形、原生质泄露。本试验的研究结果与郅晓燕等[31]研究地肤子提取物抑制苹果树腐烂病菌机理的研究结果类似，均发现植物提取物对菌丝体细胞膜结构和透性及物质合成与代谢产生了影响和干扰。

3种植物提取物的具体作用靶点和途径在本次研究中尚未得到解答。前人研究表明，黄连可能通过作用于菌体表面的蛋白，影响蛋白质合成，间接抑制核酸复制转录，进而阻止细胞分裂或所需酶的合成及外排泵的功能，从而达到抑菌的作用[32]；甘草查耳酮能影响微生物的大分子（DNA、RNA以及蛋白质）合成[33]；肉桂作用于菌体后，菌体内蛋白质合成量减少，特别对执行特定催化作用酶的合成进行抑制，使体内蛋白质凝固、变性，从而实现抑菌、杀菌的效果[34]。3种植物提取物抑菌作用可能与上述因素相关，其抑制稻瘟病菌生长的具体作用靶点及途径有待转录组测序进一步研究。

本研究发现，黄连、甘草和肉桂提取物对稻瘟病菌菌丝生长具有较强的抑制作用，其EC50值分别为4.17 mg/mL、4.48 mg/mL和5.22 mg/mL。抑菌机理研究表明，黄连、甘草和肉桂提取物对稻瘟病菌菌丝细胞膜具有一定破坏作用，导致细胞内电解质外渗量增加，膜质过氧化作用产物丙二醛含量增加；干扰了菌丝细胞物质合成与代谢，使细胞内丙酮酸和可溶性蛋白含量降低；改变了病原菌超显微形态，导致菌丝生长异常。