化瘀通络中药通过抑制TGF-β1/ERK通路减轻糖尿病肾病大鼠肾纤维化研究

郭 帅，方 敬，杨 帆，李雅纯，陈志强,2*

1.河北中医学院，河北 石家庄 050000

2.河北省中医院，河北 石家庄 050000

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见且严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾脏病的主要原因[1]。DN的主要病理改变为肾小球和肾间质内细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积，导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化[2]。转化细胞因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是重要的致纤维化因子[3]。Smad依赖的信号通路是传导TGF-β1的主要通路，此外，Smad非依赖的TGF-β1信号通路在肾纤维化中也具有重要作用[4]。Smad非依赖途径以细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路为主，ERK信号通路是TGF-β1介导肾纤维化的另一重要信号通路[5]。因此，阻断TGF-β1/ERK信号通路对于防治DN肾纤维化具有重要意义。

DN经久不愈，久病多瘀、久病入络。瘀血阻络是DN的基本病机，化瘀通络中药临床上对DN具有较好的疗效[6-7]。课题组前期研究从DN大鼠的一般情况和实验室指标等方面证实了DN中“血瘀证”的客观存在[8]，并筛选出化瘀通络中药治疗DN大鼠的最佳剂量，化瘀通络中药具有肾保护作用，作用比阳性对照药物厄贝沙坦更稳定、持久；化瘀通络中药能够通过抑制TGF-β1/Smad信号通路来减轻DN肾病理损伤[9-12]。本研究探讨化瘀通络中药对DN大鼠肾组织TGF-β1/ERK信号通路相关蛋白表达的影响，为其临床应用提供依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠40只，3～5周龄，体质量60～80 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。动物饲养于河北中医学院动物房，温度（23±2）℃、湿度50%～70%，12 h光照/12 h黑暗交替，通风良好，自由进食饮水。动物实验经河北中医学院伦理委员会批准（批准号DWLL2020052）。

1.2 药品与试剂

化瘀通络中药所用药物为颗粒剂，均由广东一方制药有限公司惠赠，规格如下：丹参（批号8080971，1.8 g/袋，相当于10 g饮片）、川芎（批号8122561，1.3 g/袋，相当于6 g饮片）、地龙（批号7125701，1.0 g/袋，相当于10 g饮片）、水蛭（批号8081351，1.5 g/袋，相当于3 g饮片）、全蝎（批号8050111，1.0 g/袋，相当于3 g饮片）；高脂饲料（批号HD001）购自北京博泰宏达生物技术有限公司；链脲佐菌素（批号S8050）购自北京索莱宝科技有限公司；肌酐试剂盒（批号AUZ3562）、尿素氮试剂盒（批号AUZ3611）、尿酸试剂盒（批号AUZ3629）购自美国Beckman公司；III型胶原（collagen type III，Col-III）兔多克隆抗体（批号GB111629）、HRP标记的山羊抗兔抗体（批号GB23303）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；TGF-β1兔单克隆抗体（批号ab215715）购自英国Abcam公司；β-actin小鼠单克隆抗体（批号AF0003）购自上海碧云天生物技术有限公司；c-Raf兔单克隆抗体（批号53745）、磷酸化c-Raf（p-c-Raf）兔单克隆抗体（批号9427）、丝裂原活化细胞外信号调节蛋白激酶（mitogen-activated extracellular signal regulated kinase，MEK）兔单克隆抗体（批号8728）、p-MEK兔单克隆抗体（批号9154）、兔单克隆抗体（批号4695）、p-ERK兔单克隆抗体（批号4376）购自美国CST公司。

1.3 仪器

HEMIX-180全自动生化分析仪（日本Sysmex公司）；Active血糖仪（瑞士Roche公司）；RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；BX51光学显微镜（日本Olympus公司）；Case Viewer 2.2扫描浏览软件（匈牙利3DHISTECH公司）；Image-Pro Plus 6.0图片分析软件（美国Media Cybemetics公司）；Stepone plus荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；22331 hamburg蛋白浓度定量仪（德国Eppendorf公司）；DYCZ-24DN电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；WSE-4040半干转膜仪系统（日本ATTO公司）；Odyssey红外激光扫描仪（美国LI-COR公司）。

2 方法

2.1 造模、分组与给药

大鼠适应性饲养1周，随机选取10只作为对照组常规饲养，其余大鼠给予高脂饲料饲养6周。大鼠禁食不禁水12 h，对照组ip枸橼酸缓冲液，其余ip链脲佐菌素（40 mg/kg），72 h后于尾静脉连续采血3次，血糖≥16.7 mmol/L则表明DN模型制备成功。造模过程中无大鼠死亡，2只大鼠血糖＜16.7 mmol/L予以剔除。将造模成功的大鼠随机分为模型组和化瘀通络中药组，每组14只。化瘀通络中药组丹参、川芎、地龙、水蛭、全蝎剂量分别为1.35、1.08、0.9、0.54、0.54 g/kg（以中药饮片量计），相当于临床等效剂量，以上5种颗粒按剂量配比混匀，溶于热纯净水配制成混悬液，放置至室温。化瘀通络中药组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积纯净水，1次/d，连续16周。

2.2 化瘀通络中药对DN大鼠空腹血糖的影响

给药第0、4、8、12、16周末，大鼠尾静脉采血，采用血糖仪检测各组大鼠空腹血糖水平。

2.3 化瘀通络中药对DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影响

给药结束后，大鼠禁食12 h，ip 10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，腹主动脉采血，离心取上清，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平。

2.4 化瘀通络中药对DN大鼠肾脏组织病理变化的影响

大鼠脱颈椎处死，取肾组织于4%中性甲醛中固定，梯度乙醇脱水、透明、浸蜡后，石蜡包埋并切片（厚3 μm），进行PAS和Masson染色，脱水后，中性胶封片，于显微镜下观察肾脏病理变化。PAS染色中，糖蛋白呈红色，细胞核呈浅蓝色；Masson染色中，胶原纤维呈蓝色，免疫复合物、纤维蛋白呈红色。

2.5 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织Col-III和TGF-β1蛋白表达的影响

取各组大鼠肾组织石蜡切片，于二甲苯常规脱蜡，加入柠檬酸抗原修复，于3%双氧水溶液室温避光孵育25 min阻断内源性过氧化物酶，于3%牛血清白蛋白中室温封闭30 min，分别加入Col-III抗体（1∶300）、TGF-β1抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔抗体，室温孵育50 min，DAB显色并水洗后，苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。于显微镜下观察，细胞核为蓝色，阳性表达为棕黄色。

2.6 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织TGF-β1 mRNA表达的影响

按照试剂盒说明书提取各组大鼠肾组织总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：TGF-β1上游引物5’-ATGGTGGACCGCAACAAC-3’，下游引物5’-TGAGCACTGAAGCGAAAGC-3’；GAPDH上游引物5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’，下游引物5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’。

2.7 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织c-Raf、p-c-Raf、MEK、p-MEK、ERK和p-ERK蛋白表达的影响

取各组大鼠肾组织，加入裂解液匀浆，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，室温封闭30 min，分别加入c-Raf抗体（1∶600）、p-c-Raf抗体（1∶750）、MEK抗体（1∶600）、p-MEK抗体（1∶800）、ERK抗体（1∶600）、p-ERK抗体（1∶750）、β-actin抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔抗体，室温孵育30 min后显影，采用Quantity one软件分析目标条带的灰度值。

2.8 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计学处理，数据以±s表示，方差齐者采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；方差不齐者采用Kruskal-Wallis检验。

3 结果

3.1 各组大鼠死亡情况

给药16周内，模型组大鼠死亡4只，化瘀通络中药组大鼠死亡3只。经大体解剖发现5只大鼠死于感染，表现为皮下多发脓肿及肾脓肿；另2只大鼠死亡原因不明确，推测与高血糖导致的酮症酸中毒或高渗性高血糖状态有关。

3.2 化瘀通络中药对DN大鼠空腹血糖的影响

如图1所示，给药第0、4、8、12、16周末，与对照组比较，模型组大鼠空腹血糖水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，化瘀通络中药组大鼠空腹血糖水平无明显变化。

图1 化瘀通络中药对DN大鼠空腹血糖的影响 (±s )Fig.1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on fasting blood glucose in DN rats (±s)

3.3 化瘀通络中药对DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，化瘀通络中药组大鼠血清中肌酐和尿素氮水平显著降低（P＜0.01），尿酸水平有所降低，但无显著性差异。

表1 化瘀通络中药对DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影响 (±s)Table 1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on levels of creatinine,urea nitrogen and uric acid in serum of DN rats(±s)

表1 化瘀通络中药对DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影响 (±s)Table 1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on levels of creatinine,urea nitrogen and uric acid in serum of DN rats(±s)

与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; **P ＜ 0.01 vs model group

组别 n 肌酐/(μmol·L−1) 尿素氮/(mmol·L−1) 尿酸/(μmol·L−1)对照 10 24.57±3.18 8.22±1.62 43.97±10.68模型 10 58.10±7.75## 18.68±1.49## 88.27±23.82##化瘀通络中药 11 44.85±5.71** 13.45±2.78** 70.74±16.05

3.4 化瘀通络中药对DN大鼠肾脏组织病理变化的影响

如图2所示，对照组大鼠肾脏结构正常，肾小球、肾小管及间质均无异常改变；模型组大鼠肾小球毛细血管袢肥大，基底膜轻中度增厚，系膜细胞和基质轻中度增生，肾小管空泡和颗粒变性，局灶状萎缩，肾间质有较多的胶原纤维沉积；与模型组比较，化瘀通络中药组大鼠肾脏损伤和胶原纤维沉积均有一定程度地减轻。

图2 化瘀通络中药对DN大鼠肾脏组织病理变化的影响(×200)Fig.2 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on pathological changes of kidneys in DN rats (× 200)

3.5 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织Col-III和TGF-β1蛋白表达的影响

如图3所示，对照组大鼠肾间质有少量Col-III和TGF-β1蛋白沉积；模型组大鼠肾小管间质Col-III和TGF-β1阳性表达增加；化瘀通络中药组大鼠肾间质Col-III和TGF-β1沉积减少。

图3 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织Col-III和TGF-β1蛋白表达的影响Fig.3 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on expressions of Col-III and TGF-β1 in kidney tissue of DN rats

3.6 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织TGF-β1 mRNA表达的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠TGF-β1mRNA表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，化瘀通络中药组大鼠TGF-β1mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。

图4 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织TGF-β1 mRNA表达的影响 (±s )Fig.4 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on TGF-β1 mRNA level in kidney tissue of DN rats (±s)

3.7 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表达的影响

如图5所示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，化瘀通络中药组大鼠肾组织p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。

图5 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表达的影响 (±s )Fig.5 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on expressions of p-c-Raf,p-MEK and p-ERK in kidney tissue of DN rats(±s)

4 讨论

瘀血既是DN的主要病理产物，又是其重要致病因素，贯穿DN始终。DN病程冗长，叶天士在《临证指南医案》中强调“凡经主气，络主血，久病血瘀”“初为气结在经，久则血伤入络”。瘀阻肾络，气血不畅，水谷精微外泄而见蛋白尿；瘀血阻络，新血不生，脾肾失养，水湿停滞，故见水肿；DN晚期，脾肾衰微、瘀血内停、三焦壅滞、气机逆乱，可见恶心、呕吐、纳差。因此，瘀血阻络是贯穿DN全程的主体病机。化瘀通络法是DN的基本治法，在辨证论证的基础上加用化瘀通络中药成为治疗DN的基本原则。课题组经过多年的临证筛选，最终确定了丹参、川芎、地龙、水蛭和全蝎5味中药作为相对固定的治疗DN的化瘀通络药物。《血证论·瘀血》谓“瘀血在经络脏腑之间，则结为癥瘕”，《医宗必读》曰“盖积之为义，日积月累，匪伊朝夕”，可见瘀血久不消散，息以成积，深入于络，难以祛之，故在使用丹参、川芎常规活血化瘀药物的基础上，加用水蛭、地龙、全蝎等虫类药入络搜剔，此5种药合用，共奏化瘀通络之效，可使络脉得通、瘀滞尽去。

DN的病理特征为正常肾单位丢失、大量肌成纤维细胞激活和增殖、ECM过度沉积、肾小球和肾小管基底膜增厚、肾小球内K-W结节形成、小管间质纤维化，最终导致DN肾纤维化[2]。胶原是ECM的骨架结构，Col-III是肾间质ECM的主要成分。因此，检测肾组织中Col-III蛋白表达，对评估肾纤维化程度、判定DN预后具有重要意义。本研究结果显示，模型组大鼠出现了DN典型的病理改变，肾组织Col-III蛋白表达增多，血清中肌酐、尿素氮、尿酸水平升高，表明DN模型制备成功；化瘀通络中药显著减轻了肾病理损害和纤维化程度；模型组大鼠空腹血糖水平显著升高，化瘀通络中药无明显降糖作用，提示化瘀通络中药对DN的肾保护作用并不依赖于降低血糖。

TGF-β1是肾纤维化的重要刺激因子，TGF-β1与细胞膜上的受体（TβRI、TβRII）结合，激活c-Raf/MEK/ERK途径，在肾纤维化的发生发展中发挥关键作用。c-Raf是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，活化的c-Raf磷酸化双特异性激酶MEK，继而磷酸化ERK，活性ERK易位进入细胞核或在细胞质中磷酸化多种底物，使细胞对外来信号产生生物学应答[13]。ERK是丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中研究最广泛的成员，ERK分为ERK1和ERK2 2种亚型，二者基因同源性为84%，负责调控细胞增殖、分化、衰老、死亡、迁移等生理过程。白色念珠菌感染导致的小鼠肾纤维化模型中，TGF-β1/c-Raf/ERK1/2处于高度激活状态，c-Raf抑制剂可显著减轻肾纤维化和损伤[14]。ERK信号通路在多种肾纤维化动物模型中均呈激活状态，抑制该通路可以改善肾纤维化[15-18]。TGF-β1可激活体外培养的足细胞ERK信号通路，并诱导金属基质蛋白酶-9表达，从而抑制ECM降解[19]。在高糖处理的小鼠系膜细胞SV40-MES13中，抑制长非编码RNA ANRIL可以通过抑制Wnt/β-catenin和MEK/ERK通路，从而抑制细胞增殖、炎症和纤维化[20]。本研究结果显示，模型组大鼠肾组织中TGF-β1蛋白及mRNA表达水平显著升高，p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表达水平显著升高；化瘀通络中药显著下调TGF-β1蛋白及mRNA表达水平，显著降低p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表达水平，表明化瘀通络中药能够抑制DN大鼠肾组织TGF-β1/ERK信号通路的激活。

综上所述，化瘀通络中药能够改善DN大鼠的肾病理损伤和肾纤维化，其机制可能与抑制TGF-β1/ERK信号通路有关。

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