柚皮素抗肿瘤作用的研究进展

王 丹，彭 莉，周燕红

1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100

2.湖北科技学院五官医学院，湖北 咸宁 437100

肿瘤是严重影响全球人民身体健康的主要疾病之一[1]。随着人口老龄化不断增长，以及越来越多不良生活方式，如吸烟、缺乏锻炼和不健康的食物等，全球各国的肿瘤负担不断增加。虽然癌症预防、检测和治疗的技术不断进步和发展，使其死亡率有所下降，但目前常规肿瘤治疗方法和手段，如化疗和放疗，往往会导致严重毒副作用的发生。目前肿瘤研究的目标之一是开发对人体危害较小的新疗法和新药物。因此近年来天然产物备受关注。

柚皮素是从蔷薇科植物樱花Prunus yedoensisMate.花蕾和漆树科植物梗树Amacardi-um occidentaleL.果实的核壳中提取分离的一种苷元，属黄酮类化合物[2]。其化学名称为5,7,4′-三羟基黄烷酮，相对分子质量为272.252 78，分子式为C15H12O5，化学结构见图1。柚皮素是一种广泛存在于各种水果和中草药的黄酮类化合物[3]，如橙子、番茄皮、枳实、石斛、枳壳等。柚皮素可溶解于有机溶剂，如乙醇、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，微溶于水。随着药物包封材料的发展和制备工艺的改进，柚皮素被发现具有多种生物活性，如抗癌、抗突变、抗炎、抗氧化、抗增殖和抗动脉粥样硬化等[4]。近年来，有大量文献报道柚皮素在抗肿瘤方面有良好的活性，本文对柚皮素抗肿瘤作用的研究进展进行综述。

图1 柚皮素的化学结构Fig.1 Chemical structure of naringenin

1 抗肿瘤活性

研究表明，柚皮素对乳腺癌MDA-MB-231细胞，人肾母细胞瘤SK-NEP-1、G-401细胞，肺癌H23细胞，人大肠癌HT-29、SW1116、SW837细胞，人脑胶质瘤U251-MG、LNZ308细胞，人胎盘绒毛膜癌JAR、JEG3细胞等多种肿瘤细胞具有良好的抑制作用，并呈时间-剂量相关性。近几年，柚皮素的抗肿瘤作用成为研究热点，新靶点和通路的发现为其在临床癌症治疗中的早期应用提供了科学依据。

1.1 抗乳腺癌活性

研究表明，肿瘤细胞增殖减少和凋亡增加是抗肿瘤活性的重要标志[5]。Zhao等[6]研究显示，柚皮素抑制MDA-MB-231细胞增殖，调控细胞周期，使细胞周期阻滞于G1期，并诱导其凋亡。进一步研究发现[5]，柚皮素可增强含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3/7活性，并加速DNA的分解，这些效应均呈浓度相关性；体内研究也表明，柚皮素（10 mg/kg）显著增强了Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、Caspase-3、Caspase-9、抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤蛋白2（B-cell lymphoma protein 2，Bcl-2）和Bcl-2同源剪接变异体（Bcl-2 homologue splice variants，Bcl-xL）的蛋白水平，这表明柚皮素可以促进乳腺癌凋亡。通过验证各种抗氧化酶的水平表明柚皮素可降低大鼠脑缺血再灌注损伤硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、蛋白质羰基（protein carbonyl，PCO）和硝酸盐的水平，并上调谷胱甘肽（glutathione，GSH）、维生素C（vitamin C，VC）、维生素E（vitamin E，VE）和糖皮质激素受体（glucocorticoid receptors，GR）的表达。可见，柚皮素可通过阻止G0/G1期细胞进展抑制MDA-MB-231细胞的增殖，还可通过诱导线粒体依赖的细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。

1.2 抗肾母细胞瘤活性

柚皮素在体内、外对人肾母细胞瘤WT细胞均有抑制作用。研究表明Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）家族的关键成员TLR4可以激活核因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB），从而诱导多种细胞因子，调节Bcl-2、Bax、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和一系列肿瘤相关基因的表达，从而促进肿瘤发生和发展[7-9]。Li等[10]研究表明柚皮素剂量和时间相关性地抑制人SK-NEP-1和G-401细胞的生长，抑制WT细胞中TLR4mRNA和蛋白的表达以及NF-κB中p65磷酸化；证实在WT细胞中，过表达TLR4部分逆转柚皮素诱导的WT细胞生长抑制。在体内，柚皮素（15、30 mg/kg）也是通过调控TLR4的表达和p65的磷酸化来抑制WT细胞的生长，与体外结果一致。由此可证明，柚皮素通过TLR4/NF-κB通路在肿瘤的发生、发展中发挥至关重要的作用。

1.3 抗肺癌活性

蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）蛋白是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路活动的主要介质，在大多数非小细胞肺癌病例中常过度表达[11]。文献报道柚皮素与放疗联合给药能促进H23细胞凋亡。Baruah等[12]发现柚皮素单独给药也能剂量相关性地抑制H23细胞的增殖，降低H23细胞的存活率，并进一步显示了柚皮素对H23细胞的化疗和放射增敏潜力，增加了促氧化剂的能力；柚皮素降低了磷酸化的Akt（p-Akt）、Akt、p21蛋白和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达，并促进DNA的损伤。在柚皮素治疗组中，Bax、Caspase-3mRNA水平升高，而Bcl-2、Bcl-xLmRNA水平降低。可见，柚皮素能通过下调Akt表达和促进细胞凋亡来增加肺癌细胞对辐射的敏感性。

1.4 抗大肠癌活性

柚皮素目前已制成纳米乳化制剂，这种剂型更有利于药效的发挥。近年来，柚皮素纳米粒制剂在癌症化学预防、溃疡性结肠炎等领域的研究越来越多，因其在临床应用中具有低毒性等优势[13]。Raeisi等[14]发现，柚皮素的新制剂（纳米粒）能促进DNA断裂、核浓缩和细胞收缩，并对肿瘤细胞壁造成高度破坏；进一步研究证明使用Annexin VFITC/PI染色进行流式细胞术分析，发现制成纳米结构脂质载体的柚皮素可显著增加凋亡细胞的数量；利用实时荧光定量聚合酶链式反应研究促凋亡和抗凋亡基因的表达，结果表明，柚皮素可降低Survivin和Bcl-2mRNA的表达。此外，在空白纳米颗粒处理的HT-29细胞中证实没有细胞毒性，半数抑制浓度（half-inhibitory concentration，IC50）为（150.00±11.04）μmol/L。Abaza等[15]研究表明，柚皮素通过促进S期和G2/M期细胞周期停滞，诱导SW1116和SW837细胞凋亡，且呈时间和剂量相关性。柚皮素可显著下调大肠癌细胞周期相关蛋白基因Cdk4、Cdk6和Cdk7表达，同时显著上调细胞周期依赖性激酶抑制剂基因p18、p19和p21表达。这些结果说明柚皮素可通过调控细胞周期抑制细胞生长。另外研究还发现促凋亡相关基因Caspases-3、7、8、9，Bak，AIF，Bax表达显著上调；而抗凋亡相关基因Bcl-2、x-IAP和c-IAP-2等表达显著下调。可见，柚皮素的抗大肠癌活性是通过调节细胞周期、促凋亡基因上调和抗凋亡基因下调来实现的。

1.5 抗胶质瘤活性

载脂蛋白2配体（apolipoprotein 2 ligand，APO2L）可通过与死亡受体相互作用诱导细胞凋亡。研究发现[16]，柚皮素能选择性抑制APO2L，促进U251-MG和LNZ308细胞凋亡，抑制U251-MG和LNZ308细胞增殖；同时，柚皮素（80 μmol/L）、APO2L（30 ng/mL）或柚皮素＋APO2L处理均没有明显的细胞毒性。进一步研究发现，柚皮素是以通过Caspase-9和Caspase-3信号通路触发APO2L诱导的细胞凋亡。柚皮素治疗组中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL水平略有降低，而单独使用柚皮素或柚皮素＋APO2L的联合用药会增加促凋亡的细胞激动剂Bad、BakmRNA水平；此外，单独使用柚皮素或柚皮素＋APO2L联合作用于细胞后可增强凋亡相关因子DR4、DR5、TRADD、p21和p53mRNA的表达。在小鼠体内，单独用柚皮素（50 mg/kg）或柚皮素＋APO2L（50 mg/kg＋100 μg）给药时，DR4、DR5、TRADD、p21、p53mRNA的表达明显上调。由此表明，柚皮素和APO2L的联合疗法通过胱天蛋白酶和p53的信号通路激活细胞凋亡，从而在体外和体内抑制神经胶质瘤的进展。

1.6 抗人胎盘绒毛膜癌活性

Park等[17]研究表明，柚皮素可抑制人胎盘绒毛膜癌细胞的增殖和迁移。为了研究柚皮素对绒癌细胞的凋亡作用，采用TUNEL染色检测柚皮素处理过的JAR和JEG3细胞，结果表达了很强的红色信号，而在未处理过的绒癌组织中未检测到信号。此外，柚皮素诱导活性氧的产生和活性氧介导的细胞凋亡，以及JAR和JEG3细胞膜的脂质过氧化和谷胱甘肽的耗竭。活性氧诱导的细胞死亡效应主要通过调节JAR和JEG3细胞中的细胞外调节蛋白激酶1/2-丝裂原活化蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases1/2-mitogen-activated protein kinase，ERK1/2-MAPK）和p38丝裂原激活蛋白激酶（p38 MAPK）信号转导通路来实现。通过蛋白质印迹分析确定了柚皮素对JAR和JEG3细胞信号转导途径的剂量相关性作用，显著增加了JAR和JEG3细胞中ERK1/2的磷酸化。因此，结果表明柚皮素通过调控绒毛膜癌细胞的增殖和凋亡发挥抗癌活性，这使其成为治疗胎盘绒毛膜癌的潜在补充剂。

柚皮素的抗肿瘤活性见表1。

表1 柚皮素的抗肿瘤活性Table 1 Antitumor activity of naringenin

2 抗肿瘤作用机制

肿瘤的发生经历了起始、发展和演化3个阶段，而柚皮素主要从化学预防的角度控制肿瘤的起始和发展，通过实现抗氧化、免疫调节和抗炎、细胞凋亡、线粒体功能等途径来预防和治疗肿瘤的发生和发展。

2.1 抗氧化

柚皮素具有较好的缓蚀性能，是一种化学基团和超氧化物歧化酶的清除剂，具有清除自由基、抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、环氧合酶、脂氧合酶、黄嘌呤氧化酶和金属离子螯合等促氧化酶活性的作用。柚皮素的抗氧化活性归因于其结构中的羟基，这些羟基活性氧有很高的反应性[18]。当促氧化活性和抗氧化防御之间的细胞动态平衡被破坏时，活性氧的产生增加，自由基积累产生的大量活性氧会引起氧化应激，氧化应激参与炎症过程的发展，导致许多退行性疾病和癌症[19]。除此之外，柚皮素还能提高几种抗氧化酶水平。在氧化还原反应不平衡的过程中，会产生白细胞介素和炎症介质。

2.2 免疫调节和抗炎

柚皮素通过调节免疫细胞、抑制趋化因子、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、细胞因子和促炎转录因子、抑制PI3K/Akt、κ激酶抑制剂/c-Jun N端激酶（IκB kinase/c-JunN-terminal kinase，IKK/JNK）发挥抗炎作用[20]。柚皮素可通过抑制转录因子，如NF-κB来调节蛋白激酶[21]。该转录因子调节炎症中涉及的几种细胞因子、趋化因子和细胞黏附分子。抑制蛋白κB（inhibitor of NF-κB，I-κB）是NF-κB的抑制分子，但在炎症过程中，I-κB被磷酸化和降解。据报道，柚皮素能调节IκB和NF-κB的活性，直接影响细胞活化[22]。可调节CD4+T辅助2（Th2）细胞因子（如GATA结合蛋白3）以及信号转导及转录激活因子6的主要调控转录因子[23]。柚皮素可以抑制磷酸二酯酶，如环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）磷酸二酯酶。cAMP是炎症过程中调节不同细胞功能的第二信使分子。高水平的cAMP与抗炎功能有关。磷酸二酯酶可以水解cAMP以保持正常水平。柚皮素对磷酸二酯酶的抑制作用有可能阻止cAMP降解并延长cAMP信号传导[24-25]。此外，体外研究和体内动物模型的结果表明，柚皮素可以通过抑制NF-κB通路和激活与抑制多种促炎信号通路有关的AMPK，下调几种炎症标志物的表达，如TLR4、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、诱导型一氧化氮合酶和COX-2[26]。

2.3 诱导肿瘤细胞凋亡

癌细胞对凋亡具有抵抗力，通常由一系列信号转导途径、促凋亡蛋白和Caspase以及Bcl-2家族蛋白诱导[27-28]。凋亡有2个主要的信号级联（图2）：内源性的线粒体途径，Bcl-2家族蛋白启动Caspases-9、3和7的激活；外源性受体途径，与肿瘤坏死因子超家族有关，主要的信号蛋白是Caspase-8。癌基因（如c-Myc）过表达，导致细胞增殖和p53抑制，并在癌细胞中激活Bcl-2家族的抗凋亡蛋白[29]，而促凋亡蛋白和Caspase可能下调。柚皮素可以靶向调节凋亡信号级联刺激细胞死亡途径[30]。柚皮素可通过上调p53表达、Bax和Caspase-3裂解，下调Bcl-2和Survivin，诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡[31]。柚皮素诱导的外源性凋亡途径与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族蛋白的过表达有关。因此，柚皮素可以通过激活抗凋亡蛋白和抑制促凋亡蛋白和Caspase双重机制激活癌细胞中的细胞凋亡信号通路。

图2 柚皮素诱导肿瘤细胞凋亡的途径Fig.2 Pathways of apoptosis induced by naringenin in tumor cells

2.4 影响肿瘤线粒体的功能

肿瘤细胞由于线粒体功能高度异常，其代谢与正常细胞相比发生了改变[32]。因此，最近对天然化合物使线粒体恢复正常模式进行了研究，柚皮素也作为潜在的候选药物进行了测试[33]。线粒体至少可通过3种主要机制促成恶变：（1）线粒体活性氧有助于积累潜在的致癌DNA缺陷，以激活潜在的致癌信号通路；（2）特定线粒体代谢物的异常积累，包括反丁烯二酸、琥珀酸和2-羟基戊二酸，具有显著的转化作用；（3）线粒体外膜通透性或线粒体通透性转变的功能缺陷是新形成的恶性前体细胞生存所必需的，否则将趋于调控细胞死亡[34]。线粒体中Bcl-2家族抗凋亡蛋白的过度表达导致对凋亡途径的抵抗。柚皮素相应地降低了SGC-7901细胞中Bcl-2的表达，从而进一步验证了柚皮素的抗肿瘤机制[35]。

3 结语

柚皮素是一种有效、安全、耐受性好、口服可用的生物黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎等多方面作用。柚皮素对乳腺癌、人肾母细胞瘤、肺癌、人大肠癌、人脑胶质瘤和人胎盘绒毛膜癌等有抗增殖和迁移能力。其Caspase家族、Bak、Bax及MAPK通路等机制在柚皮素诱导后，生长凋亡调控相关的表达在癌细胞中活性增强，促进癌细胞凋亡。另外，研究表明柚皮素的纳米制剂对人正常细胞是安全的，但抑制肿瘤恶性表型等方面的研究较少，因此对疾病预防和肿瘤靶向治疗的具有重要临床意义。许多研究仍在进行中，无论是柚皮素原药还是纳米制剂，都应指向性地展开临床试验，以明确人体给药剂量与有效性。综上所述，柚皮素单独或与其他药物联合应用可以减轻以往药物的毒副反应，其多靶点抗肿瘤临床疗效值得进一步研究，使其有益于人类肿瘤的防治，为人类抗肿瘤药物的开发应用提供思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突