小柴胡颗粒生物靶标网络及潜在作用机制解析*

毕聪，郑如文，杜海泳，张俊华，江志强，何逸禧，廖彦，陈秀丽，彭维，姚宏亮，刘宏

1. 广州白云山光华制药股份有限公司，广东广州510285

2. 中山大学生命科学学院/广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东广州510275

3. 广东省生物资源应用研究所，广东广州510260

小柴胡颗粒系广州白云山光华制药股份有限公司生产的名优中药品种，由柴胡、黄芩、半夏（姜制）、党参、生姜、甘草、大枣等七味药材组成，具有解表散热、疏肝和胃功效，用于外感病、邪犯少阳证［1］。小柴胡颗粒在治疗病毒性传染病方面具有显著疗效：2003 年被列入广东省抗击“非典”专用药物［2-3］；2009 年用于抗击全球“甲型流感”［4］；2013 年被广东省卫健委列入“登革热诊疗指引”；2020 年被列入《广东省新型冠状病毒肺炎中医药治疗方案（试行第二版）》［5］。然而，小柴胡颗粒作用靶点有哪些？其作用机制尚有待系统挖掘。

网络药理学技术以系统生物学和生物信息学为基础，融合多向药理学、计算生物学、网络分析、分子对接［6］等多学科内容，通过计算机模拟构建“药物-靶点-通路-疾病”多层次网络，整体探寻药物与疾病间的关联［7］。这与中药整体作用的特点相契合，有利于解决中药活性成分快速筛选、药效靶点预测、配伍内涵解析等关键问题［8-10］，加速了中药现代化、国际化进程。

本文基于网络药理学技术，通过筛选小柴胡颗粒的活性成分与作用靶点，分析作用靶点PPI网络并进行GO 功能、KEGG 通路富集，构建小柴胡颗粒活性成分-靶点-通路网络，解析小柴胡颗粒的潜在作用机制。

1 实验方法

1.1 活性成分及作用靶点筛选

采用中药系统药理数据库（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）分析平台［11］，分别以“北柴胡”“黄芩”“甘草”“党参”“大枣”“生姜”“半夏”为关键词，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥30%、化合物类药性（druglike，DL）≥0.18 为筛选条件［11-12］，获取各味药材化学成分及靶点。通过UniProt 数据库（https：//www. uniprot. org/）将筛选出的作用靶点蛋白翻译成相应基因，所有靶点设置为“Homo sapiens（人类）”。将所得化学成分与靶点相应基因导入Cytoscape 3.7.0（https：//cytoscape. org//），结合“Network Analysis”选择度值（degree）≥10 的成分作为主要活性成分，各成分对应的靶点为潜在作用靶点。

1.2 靶蛋白相互作用（PPI）网络构建及hub基因筛选

利用STRING 平台（https：//string-db. org/）［13］构建小柴胡颗粒作用靶蛋白互作（PPI）网络模型，将蛋白种类设置为“Homo sapiens（人类）”进行操作，最低相互作用得分设为中等置信度“medium confidence（0.4）”，其余保持默认设置。下载PPI网络模型“TSV”数据，导入Cytoscape3.7.0，进行PPI网络可视化分析。采用“cytoHubba”功能的“最大集团中心性（maximal clique centrality，MCC）”算法分析，选择得分前10的基因作为hub基因。

1.3 GO功能富集、KEGG通路分析

将靶点相应基因导入Cytoscape 3.7.0 中“ClueGO”［14］及“CluePedia”插件，更新数据库，种类设置为“homo sapiens（人类）”，设置阈值P＜0.05，其他参数保持默认，分别对潜在靶点进行GO （gene ontology） 功 能 富 集 分 析、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路分析，并使用GraphPad可视化。

1.4 活性成分—靶点—通路网络构建

将活性成分及靶点相应基因导入Cytoscape3.7.0，绘制活性成分—靶点—通路网络图［15］。每个节点（node）是基因、化合物或通路，节点与节点之间的连接（Edge）代表这些生物分子之间的相互关系。选择度值和介数作为评价节点在网络中重要性的拓扑参数。度值（degree）表示网络图中节点之间的连接数目，度值越大说明该化合物与多个靶点有关联；介数（edge betweenness）是网络中所有最短路径中经过该节点的路径的数目与最短路径总数的比值。

2 实验结果

2.1 活性成分及作用靶点筛选

通过TCMSP 数据库，在OB≥30%、DL≥0.18条件下共筛选出165 个化学成分和248 个作用靶点，结合Cytoscape 中“Network Analysis”所得各成分degree 值，最终筛选出82 个主要活性成分以及242 个潜在作用靶点， 结果见表1和表2。

由表1可知，小柴胡颗粒中关联靶点数量靠前的成分主要为槲皮素、山奈酚、木犀草素、汉黄芩素、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、黄芩素和黄芩苷等黄酮类成分，以及豆甾醇、β-谷甾醇等甾醇类成分，提示这些成分可能是小柴胡颗粒发挥疗效的主要活性成分。由表2可知，小柴胡颗粒中关联化合物数量靠前的靶点有PTGS2、AR、NOS2、PRSS1、PPARG、ESR1 等，这些靶点主要与细胞生长、免疫、炎症、细胞凋亡、氧化应激等生物过程相关。

表1 小柴胡颗粒主要活性成分Table 1 The main active compounds of XCHG

续表

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2.2 靶蛋白相互作用（PPI）网络及hub基因

将242 个潜在作用靶点导入String 数据库构建PPI 网络，隐藏独立无连接的蛋白。应用Cytoscape可视化PPI 网络（图1）并计算Hub 基因（图2）。PPI 网络中节点的颜色和大小代表度值的大小，边的颜色和粗细代表蛋白之间作用关系的紧密性。图3所示为排名前10的Hub基因，分别是VEGFA、JUN、 MAPK3、 AKT1、 MMP9、 IL6、 ALB、PTGS2、CXCL8、CASP3，结果提示这些靶点可能为小柴胡颗粒发挥作用的关键靶点。

2.3 GO功能富集分析

按照生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular components，CC）和分子功能（molecular function，MF）的分类对小柴胡颗粒的242个潜在作用靶点进行功能富集分析，列出显著性最高的10 条作用靶点（图3～5）。结果表明，潜在作用靶点在生物过程上，主要富集于response to organic substance（有机物反应）、response to oxygencontaining compound（含氧化合物反应）等，涉及对有机物、含氧化合物、化学刺激的应答；在细胞组分上，主要富集于membrane raft （膜筏）、membrane microdomain（膜微区）、membrane region（膜区）等，涉及调控细胞膜筏、膜微区、质膜区、突触膜等；在分子功能上，主要富集于G protein-coupled amine receptor activity（G 蛋白偶联胺受体活性）、ligand-activated transcription factor activity（配体激活转录因子活性）等，涉及G蛋白偶联胺受体活性、转录因子活性、核受体活性、肾上腺素受体活性等。对富集结果进行功能分组（图6）发现，小柴胡颗粒潜在作用靶点的GO 功能主要涉及调控种群增殖、有机物反应、药物作用、细胞转运、稳态等。

表2 小柴胡颗粒主要作用靶点（关联化合物数量≥10）Table 2 The main targets of XCHG（Number of related compounds≥10）

2.4 KEGG通路注释分析

采用Cytoscape 对小柴胡颗粒的242 个作用靶点进行KEGG 通路分析，列出前20条通路（图7）。结果表明，20 条关键作用通路中50%与抗病毒密切相关， 包括human cytomegalovirus infection（人巨细胞病毒感染）、influenza A（甲型流感）、Epstein-Barr virus infection（EB 病毒感染）等；其他作用通路主要包括免疫及炎症相关通路，例如PI3K-Akt pathway（磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B信号通路）、MAPK pathway（丝裂原活化蛋白激酶信号通路）、TNF pathway（肿瘤坏死因子信号通路）等，凋亡相关通路apoptosis（细胞凋亡）等，抗肿瘤相关通路pathways in cancer（癌症通路）等，提示小柴胡颗粒具有广泛的抗病毒功能，其机制可能与调控免疫炎症反应、细胞凋亡、抗肿瘤等方面有关。

图1 小柴胡颗粒潜在作用靶点相互作用网络（PPI）图Fig.1 The protein-protein interaction network of XCHG

图2 靶点相互作用网络中Hub基因Fig.2 The Hub genes in the protein-protein interaction network

2.5 小柴胡颗粒活性成分—靶点—通路网络图

将82 个活性成分、242 个潜在作用靶点基因、前10 条KEGG 通路导入Cytoscape 3.7.0，构建小柴胡颗粒活性成分—靶点—通路网络（见图8）。其中，粉色代表活性成分，蓝色代表作用靶点，绿色代表通路。节点的大小代表度值（degree）大小，边的粗细与深浅代表介数（edge betweenness）大小。

3 讨 论

前期药理研究表明，小柴胡颗粒能在解热抗炎［16-17］、调节免疫［18-20］、抗过敏、镇痛［21-22］等方面发挥作用，具有显著的抗病毒功效，同时能改善肝炎和肝纤维化、保护胃黏膜、促进肠蠕动。本研究基于网络药理学技术，发现小柴胡颗粒主要活性成分有槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等黄酮类成分以及豆甾醇等甾醇类化合物，参与种群增殖、有机物反应、药物作用、细胞转运和稳态等生物过程；小柴胡颗粒关键靶点包括VEGFA、JUN、MAPK3、AKT1、 MMP9、 IL6、 ALB、 PTGS2、 CXCL8、CASP3，主要通过调控human cytomegalovirus infection、influenza A、Epstein-Barr virus infection 等抗病毒相关通路， PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、TNF signaling pathway 等炎症、免疫相关通路，apoptosis 等凋亡相关通路，以及Pathway in cancer 等抗肿瘤通路，发挥解热抗炎、调节免疫、抗病毒等作用。

图3 小柴胡颗粒潜在作用靶点的生物过程富集分析Fig.3 Biological process anlysis of potential targets of XCHG

图4 小柴胡颗粒潜在作用靶点的细胞组分富集分析Fig.4 Cellular components anlysis of potential targets of XCHG

图5 小柴胡颗粒潜在作用靶点的分子功能富集分析Fig.5 Molecular function anlysis of potential targets of XCHG

图6 小柴胡颗粒GO功能富集分类图Fig.6 Classification map of GO enrichment of XCHG

图7 小柴胡颗粒潜在靶点的KEGG通路结果图Fig.7 The KEGG pathways of potential targets of XCHG

抑制病毒感染方面，PI3K-Akt 信号通路与病毒内吞作用、病毒复制过程密切相关［23］。Liu等［24］研究发现阻断PI3K-Akt信号通路可以抑制病毒RNA 的合成与蛋白表达。Mizutani 等［25］发现JNK 和PI3K-Akt 信号通路对SARS（非典型性肺炎）病毒在Vero E6 细胞中建立持久性感染具有重要作用。本研究发现，小柴胡颗粒可能通过调控PTEN、AKT 等关键基因的表达，调控PI3K-Akt 信号通路（图9），从而进一步调控病毒入侵宿主细胞及自我复制等一系列生物活动。调节炎症与免疫方面，SARS-CoV-2（新型冠状病毒）可过度激活免疫系统，引发炎症级联反应。本研究发现，小柴胡颗粒可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、IL-17、TNF 等信号通路中的AKT、ERK、p38、NFκB、IKK 等关键基因以及抑制IL-1β、IFN-γ、IL-6、MMP-9等细胞因子，有效抑制炎症反应、调控免疫应答（图9～11）。其中，IL-6、IL-1 可抑制病毒感染所致高热，IL-8、MCP-1 与单核细胞和巨噬细胞的趋化作用相关，IKKα 可影响T 细胞的免疫应答，p38 与树突状细胞产生炎性细胞因子相关。此外，IL-6、IL-8、MCP-1 急剧上升被认为是SARS 感染出现重症的征兆，小柴胡颗粒对这些靶点的潜在作用可能会降低患者的重症率［26］。调控细胞凋亡方面，病毒在入侵的不同阶段可抑制或促进细胞凋亡，以实现病毒的大量增殖或侵染传播。本研究发现，小柴胡颗粒可能通过调控PI3K-Akt、Apoptosis 等信号通路的CASP-3-7-8-9、Bcl-2、BAX、Fas-L 等关键基因来调节细胞凋亡过程（图12）。

图8 小柴胡颗粒活性成分—靶点—通路网络图Fig.8 The active compound-target-pathway network of XCHG

图9 小柴胡颗粒在PI3K-AKT信号通路中的作用靶点Fig.9 The targets of XCHG in PI3K-Akt signaling pathway

图10 小柴胡颗粒在TNF信号通路中的作用靶点Fig.10 The targets of XCHG in TNF signaling pathway

图11 小柴胡颗粒在MAPK信号通路中的作用靶点Fig.11 The targets of XCHG in MAPK signaling pathway

图12 小柴胡颗粒在Apoptosis通路中的作用靶点Fig.12 The targets of XCHG in apoptosis

综上所述，本研究明确了小柴胡颗粒在抑制病毒复制与入侵方面的作用优势，并解析了其调控机体炎症反应、免疫应答、细胞凋亡、抗肿瘤的关键靶点及通路，这与小柴胡颗粒解表散热、舒肝和胃的功效相契合，为其药理机制解析及临床合理用药提供了依据。